BLT1拮抗劑對(duì)膿毒癥小鼠的保護(hù)作用及其可能機(jī)制.pdf

1、目的：
　　膿毒癥（sepsis）是指一種機(jī)體的炎癥與免疫亢進(jìn)狀態(tài)，通常由創(chuàng)傷、感染等因素引起，嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體的正常生理功能，預(yù)后極差且死亡率很高。免疫系統(tǒng)的功能紊亂是其病理生理過(guò)程中的重要特點(diǎn)，后期通常會(huì)出現(xiàn)頑固的免疫抑制，淋巴細(xì)胞的凋亡及其功能障礙在免疫抑制中扮演重要的角色，從而更加加重免疫功能紊亂，但是其倒底如何促進(jìn)免疫抑制和造成免疫系統(tǒng)功能紊亂目前尚不明了。
　　白三烯B4(leukotriene B4,LTB4)是由

2、花生四烯酸代謝產(chǎn)生的一類脂類介質(zhì)，作為一種強(qiáng)有力的炎性介質(zhì)和趨化因子，通過(guò)與其相應(yīng)受體結(jié)合在許多疾病中都發(fā)揮著重要作用。白三烯B4受體1(leukotriene B4 receptor1,BLT1)是LTB4的高親和力受體，主要在白細(xì)胞尤其在中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞上表達(dá)。目前已有研究表明LTB4通過(guò)BLT1參與支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、接觸性皮炎及多發(fā)性硬化等病理生理過(guò)程。U-7530

3、2是BLT1的特異性拮抗劑，可以阻斷LTB4/BLT1通路。
　　以往LTB4總是作為炎癥介質(zhì)被研究，近年其通過(guò)BLT1介導(dǎo)的免疫調(diào)控作用備受關(guān)注。目前國(guó)外已有研究表明LTB4/BLT1通路參與天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)免疫細(xì)胞功能的調(diào)控。在與免疫功能密切相關(guān)的膿毒癥中LTB4/BLT1通路是否也能發(fā)揮免疫調(diào)控作用？以及干預(yù)LTB4/BLT1通路能否影響膿毒癥的預(yù)后和免疫系統(tǒng)功能尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要研究利用特異性的BLT1拮抗劑U

4、75302阻斷LTB4/BLT1通路后，是否能改善膿毒癥小鼠的預(yù)后，是否能減少淋巴細(xì)胞的凋亡，從而探尋膿毒癥監(jiān)測(cè)和治療的新靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1、膿毒癥小鼠模型通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）術(shù)建立。將12只雄性C57BL/6小鼠按完全隨機(jī)的原則分為2組，分別是假手術(shù)組（Sham,n=6）和CLP組（CLP,n=6），手術(shù)24h時(shí)利用ELISA術(shù)檢測(cè)Sham組小鼠和CLP

5、組小鼠外周血LTB4水平以及腹腔沖洗液LTB4水平。
　　2、將30只雄性C57BL/6小鼠按完全隨機(jī)的原則分為3組，分別是假手術(shù)組（Sham,n=10）、CLP組（CLP,n=10）和CLP+腹腔注射BLT1拮抗劑U75302組（U75302,n=10），手術(shù)后1h時(shí)按分組給予生理鹽水（每只100μl）或BLT1拮抗劑U75302（每只5μg/100μl），觀察不同組別小鼠的生存時(shí)間與7d生存率。
　　3、將18只雄性C5

6、7BL/6小鼠按完全隨機(jī)的原則分為3組，分別是假手術(shù)組（Sham,n=6）、CLP組（CLP,n=6）和CLP+腹腔注射BLT1拮抗劑U75302組（U75302,n=6），手術(shù)后1h時(shí)按分組給予生理鹽水（每只100μl）或BLT1拮抗劑U75302（每只5μg/100μl）。24h時(shí)抽取各組小鼠外周血及腹腔沖洗液，并摘取各組小鼠肝組織、肺組織。通過(guò)肝肺組織病理染色檢測(cè)肝肺損傷情況，同時(shí)檢測(cè)血液及腹腔沖洗液的細(xì)菌負(fù)荷，用酶聯(lián)免疫吸附法檢

7、測(cè)血漿TNF-α、IL-6和IL-10水平。
　　4、將18只雄性C57BL/6小鼠按完全隨機(jī)的原則分3組，分別是假手術(shù)組（Sham,n=6）、CLP組（CLP,n=6）和CLP+腹腔注射BLT1拮抗劑U75302組（U75302,n=6），手術(shù)后1h時(shí)按分組給予生理鹽水（每只100μl）或BLT1拮抗劑U75302（每只5μg/100μl）。24h時(shí)采集各組小鼠腹腔沖洗液并摘取各組小鼠脾臟及胸腺，樣品處理后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠胸

8、腺T淋巴細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)檢測(cè)各組脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞及CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)小鼠腹腔沖洗液CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1、CLP術(shù)后24h時(shí)，膿毒癥小鼠外周血和腹腔沖洗液中LTB4水平較假手術(shù)組均顯著升高（P<0.05）。
　　2、CLP術(shù)后1h時(shí)給予腹腔注射BLT1拮抗劑U75302，U75302組小鼠生存時(shí)間及7d生存率高

9、于CLP組（P<0.05）。
　　3、CLP術(shù)后24h時(shí)，與CLP組相比，U75302組小鼠肝、肺組織病理?yè)p傷均減輕（P<0.05），且U75302組小鼠血液和腹腔沖洗液細(xì)菌菌落數(shù)均顯著降低（P<0.01），另外促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平在U75302組均顯著降低(P<0.01)，而抗炎細(xì)胞因子IL-10水平在各組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4、CLP術(shù)后24h時(shí)，與CLP組相比，U75302組小鼠胸腺CD3+細(xì)胞凋

10、亡比例顯著降低（P<0.01），U75302組小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞以及CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低（P<0.05），U75302組小鼠腹腔沖洗液CD4+T淋巴細(xì)胞及CD8+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)均升高（P<0.05），中性粒細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)降低（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　外周血和腹腔沖洗液中的LTB4水平在CLP組明顯升高。使用BLT1特異性拮抗劑U75302之后，可以提高CLP小鼠的