辛伐他汀納米粒對(duì)膿毒癥小鼠和A549細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、膿毒癥是威脅人類健康甚至生命的重大疾病，是重癥醫(yī)學(xué)研究的重要方向之一。經(jīng)過數(shù)十年的基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)，仍沒有根本性的治療金標(biāo)準(zhǔn)。近些來，他汀類藥物以其多向性作用，被廣泛的用于膿毒癥的治療研究。
　　有研究指出，他汀類藥物可能通過抗炎、保護(hù)改善血管功能等對(duì)膿毒癥產(chǎn)生治療作用。但在臨床及基礎(chǔ)研究中，一直對(duì)他汀類藥物的療效及臨床應(yīng)用價(jià)值存在爭議。我們通過細(xì)胞及動(dòng)物學(xué)研究，探究辛伐他汀對(duì)于膿毒癥的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床運(yùn)用提供可能依據(jù)。

2、
　　目的:
　　本研究主要探索辛伐他汀對(duì)于膿毒癥CLP模型小鼠及A549細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的分子機(jī)制，并改進(jìn)藥物劑型，通過納米粒制劑，提高藥物的藥效，減低毒副作用。
　　方法:
　　1)用LPS誘導(dǎo)，造成A549及THP-1膿毒癥細(xì)胞模型，并通過單獨(dú)培養(yǎng)及共培養(yǎng)方式，模擬膿毒癥時(shí)單核細(xì)胞釋放炎癥因子，對(duì)于肺泡上皮細(xì)胞的作用。使用辛伐他汀納米粒及普通靜脈制劑處理細(xì)胞，研究辛伐他汀的抗炎作用及對(duì)肺泡上皮可能的保

3、護(hù)作用及其機(jī)制。
　　2)在對(duì)細(xì)胞分組處理后，通過劃痕實(shí)驗(yàn)，檢測A549細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)及THP-1共培養(yǎng)作用下的遷移能力變化。用Western blot檢測THP-1及A549中iNOS及eNOS的表達(dá)變化。通過ELISA法，檢測不同組別THP-1及A549細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-6、TNF-α炎癥因子的含量。
　　3)CLP法建立小鼠膿毒癥模型，并以假手術(shù)法建立對(duì)照組模型。分別以灌胃（口服制劑組）、普通制劑尾靜脈注射、納米粒制劑尾

4、靜脈注射，研究辛伐他汀對(duì)于膿毒癥小鼠的作用，比較不同制劑的藥效差異。
　　4)按分組處理小鼠，觀察記錄小鼠生存率。24小時(shí)后，取小鼠腹主動(dòng)脈及肺，制成石蠟切片。對(duì)肺組織石蠟切片行HE染色，觀察肺部病理變化。用免疫組化法分別檢測肺組織中iNOS、eNOS表達(dá)情況，小鼠腹主動(dòng)脈中iNOS、eNOS、PI3K、AKT、Caveolin的表達(dá)情況。探究辛伐他汀對(duì)于膿毒癥小鼠體內(nèi)iNOS/eNOS的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制。
　　結(jié)果:

5、r>　　1)在細(xì)胞學(xué)研究中，LPS及辛伐他汀各型制劑預(yù)處理THP-1細(xì)胞24小時(shí)后，離心提取細(xì)胞培養(yǎng)基，加入培養(yǎng)A549細(xì)胞，再培養(yǎng)24小時(shí)。直接在A549中加入LPS及辛伐他汀各組制劑，培養(yǎng)24小時(shí)。結(jié)果提示:LPS組中， A549細(xì)胞的遷移較對(duì)照組明顯增多，辛伐他汀各組較LPS組抑制A549細(xì)胞的遷移。與THP-1共培養(yǎng)組遷移距離較單獨(dú)培養(yǎng)組增加。在THP-1及A549細(xì)胞中分別加入LPS與辛伐他汀各組制劑。結(jié)果提示:LPS可以促進(jìn)

6、THP-1分泌IL-6，TNF-α，也能促進(jìn)A549分泌IL-6，但是在LPS處理組中，同時(shí)加入辛伐他汀，IL-6、TNF-α炎性因子的水平明顯下降。
　　2)在動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠較假手術(shù)組死亡率明顯增加，辛伐他汀口服組、靜脈組、納米粒組均降低小鼠死亡率，提高生存率。小鼠CLP等處理后24小時(shí)，取小鼠肺及腹主動(dòng)脈。小鼠肺部石蠟切片行HE染色，小鼠肺部病理切片顯示，CLP小組較假手術(shù)對(duì)照組，肺泡破壞、間質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤

7、增生明顯，辛伐他汀灌胃組和CLP小組結(jié)果相近。辛伐他汀普通靜脈制劑及納米粒制劑能明顯改善小鼠的肺部病理變化。小鼠肺及腹主動(dòng)脈石蠟切片，行動(dòng)物免疫組化染色，結(jié)果提示:免疫組化檢測提示iNOS在CLP小鼠肺及腹主動(dòng)脈中，較對(duì)照組表達(dá)增加，而eNOS較對(duì)照組表達(dá)受抑制。灌胃組的結(jié)果與CLP組相似。在辛伐他汀普通靜脈制劑組及辛伐他汀納米粒制劑組中，eNOS在肺及主動(dòng)脈中均表達(dá)增多。小鼠主動(dòng)脈免疫組化結(jié)果提示，CLP小鼠Caveolin及iNOS

8、表達(dá)增加，PI3K、AKT、eNOS在辛伐他汀各組中表達(dá)增多。
　　3)在小鼠病理HE染色中提示，辛伐他汀納米粒組較CLP組明顯改善腹部的炎性滲出、肺泡破壞、肺間質(zhì)增厚等病理變化。并且較辛伐他汀靜脈制劑組效果更加明顯。在小鼠免疫組化染色中，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀納米粒較普通組抑制iNOS表達(dá)及促進(jìn)eNOS表達(dá)的效果更加明顯。
　　結(jié)論:
　　1)辛伐他汀能夠抑制THP-1細(xì)胞中IL-6、TNF-α因子及A549細(xì)胞中IL-6炎性

9、因子的釋放。
　　2)辛伐他汀能夠抑制A549細(xì)胞的遷移，從而可能維持了肺泡上皮的正常功能。
　　3)辛伐他汀能夠直接降低膿毒癥小鼠的死亡率，并且能夠明顯改善膿毒癥小鼠的肺部病變。辛伐他汀對(duì)膿毒癥小鼠可能具有一定的治療保護(hù)作用。
　　4)我們從細(xì)胞學(xué)western blot及動(dòng)物學(xué)免疫組化結(jié)果得出，辛伐他汀能夠直接抑制iNOS的表達(dá)，并且通過抑制負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白Caveolin蛋白的表達(dá)，激活PI3K/AKT通路來促進(jìn)eN