乙酸對(duì)膿毒癥小鼠巨噬細(xì)胞糖代謝的影響及其可能機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，伴有臟器功能障礙，但其確切分子機(jī)制還不清楚，缺乏有效的治療方法。巨噬細(xì)胞作為膿毒癥促炎因子的主要來源，其代謝過程發(fā)揮著重要作用。巨噬細(xì)胞的糖酵解作為治療靶點(diǎn)越來越受到人們的重視。本文研究了在小鼠盲腸結(jié)扎穿孔致膿毒癥模型中，糖代謝重要中間產(chǎn)物之一乙酸對(duì)小鼠的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.在體觀察乙酸對(duì)膿毒癥小鼠的保護(hù)作用:
　　采用小

2、鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)膿毒癥模型，觀察在CLP術(shù)后30分鐘分別腹腔注射乙酸250mg/kg或500mg/kg對(duì)小鼠7天生存率、CLP術(shù)后12小時(shí)肝和肺組織損傷、腹腔細(xì)菌清除率和小鼠血清促炎因子的水平。
　　采用腹腔注射LPS建立小鼠內(nèi)毒素血癥模型，分別在建模前12天連續(xù)給予水中添加乙酸(150mmol/l)或建模前30分鐘后給予乙酸腹腔注射(500mg/kg)預(yù)處理，檢測(cè)小鼠血清促炎因子的水平。
　　2.離體觀察乙酸對(duì)巨噬

3、細(xì)胞的作用:
　　體外分離培養(yǎng)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM)、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、人外周血單核細(xì)胞(PBMC)、人類THP-1細(xì)胞和人CD14+細(xì)胞，分別用乙酸（5～100mmol/l）預(yù)處理0.5h、1h、2h后用LPS刺激，6h后檢測(cè)小鼠血清促炎因子TNF-α和IL-6的水平。
　　3.乙酸抑炎的機(jī)制探討:
　　首先，通過離體細(xì)胞進(jìn)一步探討乙酸對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能影響的機(jī)制。體外分離培養(yǎng)BMDM，將BMDM和RAW

4、264.7巨噬細(xì)胞系用乙酸（10mmol/l）預(yù)處理0.5h，在LPS(100ng/ml)刺激后15min、30min和60min收集細(xì)胞，采用Western Blotting法測(cè)定NF-κB p65、JNK、ERK和p38 MAPK磷酸化的改變。并用siRNA敲減GPR41、GPR43兩個(gè)乙酸受體，檢測(cè)小鼠血清促炎因子TNF-α和IL-6的水平。
　　其次觀察乙酸對(duì)糖酵解的影響。體外分離培養(yǎng)BMDM，用乙酸10mmol/l預(yù)處理

5、后0.5h LPS刺激，LPS刺激后6h收集細(xì)胞與上清，測(cè)定BMDMs培養(yǎng)上清中乳酸濃度，分析2-NBDG攝取，檢測(cè)細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵酶GLUT1，PFKFB3，HK2，MCT4mRNA的表達(dá)以及細(xì)胞酸化率(ECAR)和氧耗率(OCR)。
　　隨后通過γ-干擾素（IFN-γ）或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-C SF)預(yù)處理增強(qiáng)BMDM糖酵解后進(jìn)一步觀察乙酸對(duì)巨噬細(xì)胞糖代謝及促炎因子的影響。體外分離培養(yǎng)BMDM，用100ng/m

6、l的IFN-γ或GM-CSF預(yù)孵育3小時(shí)，乙酸10mmol/l預(yù)處理后，LPS刺激6h，收集細(xì)胞和上清，ELISA法測(cè)上清TNF-α和IL-6的濃度;比色法測(cè)上清乳酸濃度;Q-PCR法測(cè)細(xì)胞GLUT1、HK2、MCT4、PFKFB3的mRNA表達(dá);流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面的GLUT1表達(dá);Western Blotting分析測(cè)定NF-κB p65和mTOR磷酸化改變。
　　4.乙酸如何抑制糖酵解:
　　首先離體觀察乙酸預(yù)處理對(duì)

7、HIF-1αmRNA以及蛋白表達(dá)的影響。體外分離培養(yǎng)BMDM，用乙酸(10mmol/l)預(yù)處理0.Sh，在LPS(100ng/ml)刺激后15min和30min，收集細(xì)胞，Q-PCR法測(cè)細(xì)胞的HIF-1αmRNA; Western Blotting法測(cè)定HIF-1α蛋白的表達(dá)。
　　隨后探討HIF-1α是不是乙酸作用所必需的，我們?cè)隗w內(nèi)和體外用DMOG，一種HIF-1α脯氨酰羥化酶的競爭性抑制劑。將BMDM，先用DMSO或DMOG

8、(0.5mmol/l)孵育2.5h，然后乙酸10mmol/l預(yù)處理0.5h，再用LPS100g/ml刺激6h后收集上清，ELISA法測(cè)定上清TNF-α和IL-6水平。觀察DMOG是否能反轉(zhuǎn)乙酸降低LPS誘導(dǎo)的促炎因子的產(chǎn)生;GlUT1、HK2、MCT4和PFKFB3的mRNA表達(dá);巨噬細(xì)胞表面GLUT1表達(dá);培養(yǎng)基中乳酸和葡萄糖的消耗率以及NF-κB的磷酸化改變。
　　又將RAW264.7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染HIF-1α特異性載體和空白載體

9、24 h后，觀察過表達(dá)HIF-1α對(duì)乙酸降低LPS誘導(dǎo)的促炎因子的產(chǎn)生作用的影響。
　　最后在體研究HIF-1α是不是乙酸保護(hù)膿毒癥小鼠作用所必需的:將40只野生型(wild type，WT) C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham，n=8），CLP模型組(CLP，n=8)，DMOG+CLP組(DMOG+CLP，n=8)，乙酸處理組(CLP+A，n=8)和乙酸+DMOG組(DMOG+CLP+A，n=8)五個(gè)組。用DMOG(3

10、20mg/kg)腹腔注射2.5h，隨后進(jìn)行CLP術(shù)，然后用乙酸(500mg/kg，ip)0.5h，觀察小鼠7天生存率;CLP模型后12小時(shí)收集小鼠肝肺組織、外周血血清、腹腔灌洗液。HE染色觀察各組小鼠肝和肺的病理變化;ELISA法測(cè)外周血血清促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平等指標(biāo)。
　　結(jié)果:
　　1.在體觀察乙酸對(duì)膿毒癥小鼠的保護(hù)作用:
　　CLP組小鼠生存率為37.5％，乙酸處理組（250mg/kg、5

11、00mg/kg）的生存率分別為75％和85％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示乙酸可明顯改善CLP小鼠的生存率。
　　CLP明顯造成小鼠肝肺組織損傷，可見肝靜脈、中央靜脈和肝竇擴(kuò)張淤血，肝小葉肝細(xì)胞萎縮和壞死，炎性細(xì)胞浸潤、變性;肺小靜脈和肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張，充血和纖維組織增生;肝功能指標(biāo)AST顯著上升;腹膜細(xì)菌計(jì)數(shù)上升;血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高。與CLP組相比，乙酸處理組的肝肺組織損傷明顯減輕，肝靜脈、

12、中央靜脈和肝竇淤血，肝細(xì)胞壞死區(qū)域以及炎性細(xì)胞浸潤顯著減少;肺小靜脈和肺泡壁毛細(xì)血管管壁重建增加，肺毛細(xì)血管充血和纖維化增生減少。乙酸處理組的AST明顯下降，腹膜細(xì)菌計(jì)數(shù)顯著降低;血漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平下降（P＜0.05）。提示乙酸可改善膿毒癥造成的組織損傷，減少促炎因子的釋放并增強(qiáng)病原體的清除能力。
　　LPS誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)毒素血癥模型結(jié)果顯示，LPS能顯著增加小鼠血清的TNF-α和IL-6，口服給藥乙酸組或者腹

13、腔注射給予乙酸組血清的TNF-α和IL-6明顯下降，說明乙酸對(duì)LPS介導(dǎo)的體內(nèi)促炎因子釋放有抑制作用。
　　2.離體觀察乙酸對(duì)巨噬細(xì)胞的作用:
　　在BMDM、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、人CD14細(xì)胞以及人類的THP-1細(xì)胞中，LPS組的促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平以及mRNA顯著增加，乙酸處理組的TNF-α和IL-6水平以及mRNA較LPS組明顯降低，提示乙酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-

14、6釋放和mRNA增加有抑制作用，且此抑制作用呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。在體外證實(shí)了乙酸的抑炎作用。
　　3.乙酸抑炎的機(jī)制探討:
　　在BMDM，LPS組的NF-κB p65的磷酸化顯著增加，而乙酸預(yù)處理導(dǎo)致激活的NF-kB p65顯著減少。LPS組的JNK、ERK和p38 MAPK的磷酸化顯著增加，然而，乙酸預(yù)處理的JNK、ERK和p38 MAPK的磷酸化與LPS組無顯著差異。
　　在BMDM，單獨(dú)敲減GPR43和G

15、PR41兩個(gè)乙酸受體，或同時(shí)敲減GPR43和GPR41的表達(dá)，LPS組的TNF-α和IL-6顯著增加，乙酸處理組的TNF-α和IL-6較LPS組明顯降低;與乙酸組相比，無論單獨(dú)敲減GPR43或GPR41的表達(dá)，還是同時(shí)敲減GPR43和GPR41的表達(dá)，TNF-α和IL-6的釋放均無顯著差異，提示GPR43和GPR41可能不涉及乙酸的抗炎作用。
　　在BMDM，LPS組的血清乳酸水平、2-NBDG攝取略有增加，GLUT1、PFKFB

16、3、HK2、MCT4 mRNA的表達(dá)迅速增加，巨噬細(xì)胞表面GLUT1表達(dá)明顯增加;而乙酸處理組的血清乳酸水平、2-NBDG攝取降低，GLUT1、PFKFB3、HK2、MCT4 mRNA的表達(dá)顯著下降，巨噬細(xì)胞表面GLUT1表達(dá)也顯著降低。這表明，在BMDM中，乙酸抑制LPS誘導(dǎo)的糖酵解率和葡萄糖消耗率增加，提示在LPS刺激后，乙酸抑制糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)。
　　預(yù)孵育IFN-γ或GM-CSF增加BMDM的糖酵解后，相較LPS組，乙酸

17、組的TNF-α和IL-6釋放減少以及GLUT1，PFKFB3，HK2，MCT4 mRNA的表達(dá)降低;而預(yù)孵育IFN-γ或GM-CSF的乙酸治療組，可見乙酸組的TNF-α和IL-6釋放減少以及GLUT1、PFKFB3、HK2、MCT4 mRNA的表達(dá)降低幾乎被完全反轉(zhuǎn)。表明增加糖酵解能逆轉(zhuǎn)乙酸的抗炎作用。
　　在LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥模型中，乙酸處理組的小鼠脾巨噬細(xì)胞的2-NBDG攝取顯著減少，說明乙酸在體內(nèi)抑制LPS導(dǎo)致的葡萄糖攝

18、取升高。
　　4.HIF-1α在糖酵解中的作用:
　　在BMDM，LPS組的HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)增加，乙酸組的HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明在乙酸在mRNA水平和蛋白水平抑制LPS刺激引起的HIF-1α上調(diào)。
　　用DMOG抑制BMDM的HIF-1α表達(dá)，結(jié)果顯示，LPS組的TNF-α和IL-6顯著增加，乙酸處理組的TNF-α和IL-6較LPS組明顯降低，DMO

19、G+乙酸組的TNF-α和IL-6與LPS組無顯著差別。在RAW264.7細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染HIF-1α特異性載體過表達(dá)HIF-1α，結(jié)果顯示，LPS組的TNF-α和IL-6顯著增加，乙酸處理組的TNF-α和IL-6較LPS組明顯降低，而HIF-1α過表達(dá)+乙酸組的TNF-α和IL-6與LPS組無顯著差別。說明HIF-1α是乙酸抑制LPS誘導(dǎo)的促炎因子釋放所必需的。
　　在BMDM，LPS組的GLUT1、PFKFB3、HK2、MCT4

20、mRNA表達(dá)明顯升高，巨噬細(xì)胞表面GLUT1表達(dá)明顯增加，乳酸產(chǎn)生和葡萄糖水平明顯增加;乙酸組的GLUT1、PFKFB3、HK2、MCT4 mRNA的表達(dá)顯著降低;DMOG+乙酸組的GLUT1、PFKFB3、HK2、MCT4 mRNA的表達(dá)顯著降低，巨噬細(xì)胞表面GLUT1表達(dá)明顯減少，乳酸產(chǎn)生和葡萄糖水平明顯減少，與LPS組無顯著差異。這表明乙酸降低LPS刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子至少部分通過HIF-1α依賴性的糖酵解的調(diào)節(jié)。
　　在BM

21、DM，LPS組的NF-κB p65磷酸化增加，乙酸組的NF-κB p65磷酸化顯著降低;DMOG+乙酸組的NF-κB p65磷酸化增加，與LPS組無顯著差異;證明DMOG能完全逆轉(zhuǎn)乙酸抑制激活NF-κB的作用。
　　最后在體研究HIF-1α是不是乙酸保護(hù)膿毒癥小鼠作用所必需的:用DMOG在體內(nèi)抑制膿毒癥小鼠巨噬細(xì)胞的HIF-1α表達(dá)，與CLP組相比，乙酸組小鼠的死亡率顯著降低，肝肺組織損傷明顯減輕，肝靜脈、中央靜脈和肝竇淤血，肝細(xì)

22、胞壞死區(qū)域以及炎性細(xì)胞浸潤顯著減少;肺小靜脈和肺泡壁毛細(xì)血管管壁重建增加，肺毛細(xì)血管充血和纖維化增生減少。乙酸處理組的AST明顯下降，腹膜細(xì)菌計(jì)數(shù)顯著降低;血漿IL-6、IL-1β，TNF-α水平下降;而用DMOG預(yù)處理后，乙酸降低死亡率的作用明顯反轉(zhuǎn)，乙酸改善膿毒癥造成的組織損傷，減少促炎因子的釋放并增強(qiáng)病原體的清除能力也明顯被反轉(zhuǎn)。說明HIF-1α在乙酸引起的糖酵解改變中起關(guān)鍵作用。
　　結(jié)論:
　　乙酸可通過抑制LPS