不同n-6-n-3多不飽和脂肪酸構(gòu)成對乳腺癌細(xì)胞的影響及膜相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是嚴(yán)重危害婦女健康的一種常見惡性腫瘤，如何有效防治乳腺癌，特別是通過膳食途徑防治乳腺癌，目前已成為國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)界一熱門話題。大量流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，膳食中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid，PUFA)與乳腺癌的關(guān)系極為密切，且不同種類的PUFA對乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有不同甚至完全相反的作用。自然界中天然存在的PUFA可分為兩大類，即n-3PUFA和n-6PUFA。研究發(fā)現(xiàn)，n-6PUFA可以

2、促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，具有顯著促癌效應(yīng)，而n-3PUFA則能夠抑制乳腺癌的發(fā)生，具有顯著抗癌效應(yīng)，關(guān)于兩者作用差異性的機(jī)制至今尚不清楚。近來有研究表明，膳食中的n-6/n-3PUFA比例，而非這些脂肪酸的單一濃度，對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有更為重要的意義，但目前也不清楚膳食中何種比例的n-6/n-3PUFA攝入才能更好地預(yù)防和抑制乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展。另有研究發(fā)現(xiàn)，大劑量n-3PUFA的攝入會損害人體的免疫系統(tǒng)功能，且單純n-3PUFA對防治

3、乳腺癌的效果也不理想。因此，深入研究膳食脂肪酸，特別是不同n-6/n-3PUFA構(gòu)成與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其分子機(jī)制，探討何種比例的n-6/n-3PUFA攝入才能更有效地預(yù)防和抑制乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義，同時這對從膳食途徑防治乳腺癌也具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。 PUFA是構(gòu)成生物膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)極為重要的組成成分，對于生物膜結(jié)構(gòu)與功能的維護(hù)和穩(wěn)定至關(guān)重要。研究顯示，n-6及n-3PUFA對細(xì)胞膜脂均具有極高的親和性，能夠直接滲透嵌

4、入細(xì)胞膜，參與并改變膜脂的構(gòu)成，而膜脂組成的改變勢必會對生物膜的物理特性和功能特性產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響到細(xì)胞的種種生命活動。因此，我們推測，不同比例的n-6/n-3PUFA作用于乳腺癌細(xì)胞，能夠?qū)θ橄侔┘?xì)胞膜脂組成、膜流動性以及關(guān)鍵跨膜信號蛋白的活性和表達(dá)等產(chǎn)生差異性影響，進(jìn)而影響到乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等，最終表現(xiàn)出促癌或抗癌的不同生物學(xué)效應(yīng)。 基于以上分析，并結(jié)合我國現(xiàn)階段居民日常膳食特點(diǎn)，本課題以不同構(gòu)成比的n-6/n

5、-3PUFA，即單純n-6PUFA、單純n-3PUFA、1:1n-6/n-3PUFA、5:1n-6/n-3PUFA、10:1n-6/n-3PUFA分別作用于雌激素受體陽性(positiveestrogenreceptor，ER+)的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系和ER陰性(ER-)的MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞系，采用MTT增殖檢測、DAPI染色、TUNEL、RT-PCR、Westernblotting、氣相色譜(GC)、熒光漂白恢復(fù)(f

6、luorescencerecoveryafterphotobleaching，F(xiàn)RAP)與激光共聚焦掃描顯微鏡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，觀察和比較不同n-6/n-3PUFA構(gòu)成對兩種乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并從乳腺癌細(xì)胞膜磷脂脂肪酸組成、膜流動性和膜信號蛋白胰島素樣生長因子受體-1(insulin-likegrowthfactor-1receptor，IGF-1R)表達(dá)等方面，系統(tǒng)探討不同n-6/n-3PUFA構(gòu)成對人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)及可能的

7、作用機(jī)制。 本研究主要實(shí)驗(yàn)及結(jié)果如下 1.細(xì)胞生長曲線與MTT檢測結(jié)果顯示，單純n-6PUFA、5:1n-6/n-3PUFA和10:1n-6/n-3PUFA組MCF-7細(xì)胞增殖速度明顯高于對照組，其中以n-6PUFA組細(xì)胞增殖速度最快，10:1n-6/n-3PUFA組次之，表明5:1以上n-6/n-3PUFA均能顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖，且此效應(yīng)隨n.6/n-3的比例增高而增強(qiáng)；與此相反，單純n-3PUFA和1:1n-

8、6/n-3PUFA處理細(xì)胞24h可見MCF-7細(xì)胞大量死亡，活細(xì)胞量明顯少于處理前和對照組，處理48h后活細(xì)胞數(shù)有所增加，但增殖較緩，表明單純n-3PUFA和1:1n-6/n-3PUFA均能顯著抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，且兩者間抑制效應(yīng)無顯著差異。MDA-MB-231細(xì)胞狀況與MCF-7細(xì)胞基本相似，提示至少高于5:1比例的n-6/n-3PUFA才能顯著促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞增殖；此外1:1n-6/n-3PUFA組細(xì)胞增殖速度略高

9、于單純n-3PUFA組，表明單純n-3PUFA和1:1n-6/n-3PUFA雖能顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，但前者抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于后者。 2.細(xì)胞形態(tài)觀察可見，正常MCF-7細(xì)胞呈典型鵝卵石狀，而MDA-MB-231細(xì)胞呈梭形，貼壁生長，聚集成甸；單純n-6PUFA、5:1n-6/n-3PUFA和10:1n-6/n-3PUFA組細(xì)胞形態(tài)與對照組比較均無明顯變化；單純n-3PUFA組和1:1n-6/n-3PUFA組細(xì)胞

10、形態(tài)發(fā)生顯著變化，細(xì)胞生長紊亂、形態(tài)異常，大量細(xì)胞皺縮變圓，胞質(zhì)凝縮，并與其周邊細(xì)胞分離，細(xì)胞貼壁性下降，表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征。 3.DAPI染色及TUNEL凋亡檢測結(jié)果表明，與對照組比，單純n-3PUFA和1:1n-6/n-3PUFA處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P＜0.05)，且兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而單純n-6PUFA組、5:1n-6/n-3PUFA組和10：1n-6/n-3PU

11、FA組細(xì)胞無凋亡現(xiàn)象發(fā)生，表明n-3PUFA和1:1n-6/n-3PUFA能顯著誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。 4.氣相色譜分析表明，n-6/n-3PUFA不同構(gòu)成比對兩種乳腺癌細(xì)胞膜的四種主要磷脂PE、PC、PS和PI的脂肪酸組成的影響基本一致，單純n-3PUFA和1:1n-6/n-3PUFA處理組可以顯著增加兩種細(xì)胞膜四種磷脂的C20:5百分比含量，降低了各磷脂的n-6/n-3比例；單純n-6PUFA和

12、10:1n-6/n-3PUFA處理組可以顯著增加兩種細(xì)胞四種磷脂的C18:2和C20:4的百分比含量，進(jìn)而升高了各磷脂的n-6/n-3的比例，且四種磷脂中PE和PC的改變最為明顯；在n-3PUFA和1:1n-6/n-3PUFA處理組，還可以觀察到PE和PC膜磷脂中的C22:6含量顯著增加，提示了EPA向DHA的轉(zhuǎn)化。以上表明不同n-6/n-3PUFA構(gòu)成能顯著改變MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞膜磷脂脂肪酸的百分比組成。

13、 5.以熒光探針NBD-C6標(biāo)記細(xì)胞膜磷脂，利用熒光漂白恢復(fù)(FRAP)技術(shù)和激光共聚焦掃描顯微鏡檢測膜流動性變化的結(jié)果表明，單純n-6PUFA、單純n-3PUFA和1:1n-6/n-3PUFA處理MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞2h，細(xì)胞膜流動性均顯著升高(P＜0.05)，表現(xiàn)為擴(kuò)散系數(shù)顯著升高；處理12h，兩種細(xì)胞膜流動性均較2h時降低，單純n-6組膜流動性仍顯著高于對照組(P＜0.05)，而單純n-3PUFA和1:1n-

14、6/n-3PUFA組膜流動性則顯著低于對照組(P＜0.05)；表明n-3PUFA和1:1n-6/n-3PUFA能使乳腺癌細(xì)胞膜流動性產(chǎn)生波動，先使其升高，后又降低。 6.RT-PCR和Westernblotting的檢測結(jié)果表明，不同n-6/n-3PUFA構(gòu)成比對MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞IGF-1RmRNA及蛋白的表達(dá)具有不同的影響，單純n-6PUFA、5:1n-6/n-3PUFA和10:1n-6/n-3PUF

15、A均能夠顯著上調(diào)兩種乳腺癌細(xì)胞IGF-1RmRNA及蛋白水平的表達(dá)，與之相反的是，單純n-3PUFA和1:1n-6/n-3PUFA顯著下調(diào)細(xì)胞IGF-1RmRNA和蛋白的表達(dá)。 綜上所述，本研究表明，不同n-6/n-3PUFA構(gòu)成對乳腺癌細(xì)胞的影響是不同的。n-6/n-3PUFA構(gòu)成比高于5:1時具有顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)，而n-6/n-3PUFA構(gòu)成比低于1:1時則具有抗乳腺癌細(xì)胞增殖、而誘導(dǎo)其凋亡的作用。這可能與兩種多