n-3多不飽和脂肪酸通過AA代謝通路促進骨折愈合.pdf

1、一、研究背景:
　　 骨折愈合是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，其關(guān)鍵在于炎癥反應(yīng)、軟骨形成、軟骨內(nèi)骨化、膜內(nèi)骨化和骨痂塑形等重要細胞過程。骨折愈合中軟骨內(nèi)骨化始于骨髓基質(zhì)干細胞聚集并初期分化為軟骨細胞，隨后位于中央的軟骨細胞經(jīng)增殖、成熟、肥大，隨后經(jīng)過終末期分化、基質(zhì)鈣化而軟骨內(nèi)骨化。骨折愈合中骨痂軟骨細胞，與骨骼骨發(fā)育過程中骺生長板軟骨細胞相似，可分為初期分化、增殖期、成熟期和肥大期，經(jīng)終末期分化、基質(zhì)鈣化而軟骨內(nèi)骨化，但骨痂中軟骨細

2、胞排列較紊亂，不如骨骺生長板中軟骨細胞柱規(guī)則。
　　 動物模型常用于研究骨折愈合，與大動物相比小鼠骨折模型有許多優(yōu)點，最為重要的是，小鼠有廣泛的抗體譜和基因靶目標(biāo)可用，可進行骨折愈合和再生的分子機制研究。隨著小鼠基因圖譜的繪制，近年來轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除小鼠的出現(xiàn)，能夠有機會觀察單個基因在骨折愈合中的作用，小鼠成為很好的實驗動物，因此，小鼠骨折模型被認(rèn)為是理想的骨折模型。與小鼠脛骨相比，股骨是形態(tài)較直的長管狀骨，內(nèi)外徑相對一致，

3、建立標(biāo)準(zhǔn)的骨折模型較易，且骨折愈合后可進行扭轉(zhuǎn)力學(xué)、三點應(yīng)力、四點應(yīng)力等生物力學(xué)特性檢測，所以骨折模型多選用股骨骨折模型。為進行骨折愈合過程中軟骨內(nèi)骨化的研究，我們采用髓內(nèi)針固定建立小鼠閉合性股骨骨折模型。
　　 多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，PUFAs)是具有3個以上雙鍵的18-24碳脂肪酸，是細胞膜磷脂的主要成分，依據(jù)第一雙鍵的位置不同可分為n-3PUFAs和n-6PUFAs。n-6PU

4、FAs主要包括亞油酸(linoleicacid,LA)和花生四烯酸(二十碳四烯酸，arachidonicacid,AA)。n-3PUFAs主要包括亞麻酸(alpha-linolenicacid，ALA)、二十碳五烯酸EPA(eicosapentaenoicacid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)。
　　 n-3PUFAs在許多疾病中起有益作用。n-3PUFAs對于正常生長發(fā)育是至關(guān)重要

5、的，對于預(yù)防和治療許多臨床疾病是重要的。n-3PUFAs能改善高脂血癥，對心血管疾病、2型糖尿病起防治作用。n-3PUFAs具有抗腫瘤作用。n-3PUFAs還具有炎性保護作用，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及自身免疫性疾病具有治療效果，對結(jié)腸炎具有保護作用。
　　 就骨健康而言，n-6PUFAs(AA)和n-3PUFAs(EPA、DHA)是最重要的脂肪酸。AA的代謝產(chǎn)物類前列腺素(prostanoids，PGs)和白三烯(leukotrien

6、es，LTs)，作為炎性介質(zhì)促進或抑制骨與軟骨代謝。近年來，n-3PUFAs對小鼠、大鼠及人類骨代謝起有益作用逐漸被報道。n-3PUFAs對骨鈣平衡是有益的，可促進和維持骨密度，能改善骨微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)強度，對健康、衰老、雌激素缺乏及炎性狀態(tài)下的骨健康起保護作用。n-3PUFAs對骨代謝是有益，但目前國內(nèi)外尚缺乏n-3PUFAs對骨折愈合影響的研究，而此類研究對臨床具有重要意義。
　　 二、研究目的:
　　 1.研究n-

7、3多不飽和脂肪酸對骨折愈合的影響
　　 2.研究n-3多不飽和脂肪酸對骨折愈合的作用機制
　　 三、研究方法:
　　 1.建立小鼠閉合性股骨骨折模型
　　 本研究中，根據(jù)三點折彎應(yīng)力原理，改良設(shè)計制作用于制造小鼠股骨骨折的骨折模型架，設(shè)立了理想的打擊重量、打擊速度、打擊深度等參數(shù)，造成穩(wěn)定一致的股骨橫形骨折。小鼠的骨骼細小，且周圍軟組織豐厚，建立標(biāo)準(zhǔn)閉合性骨折模型時，需要有豐富的解剖基礎(chǔ)和外科手術(shù)技術(shù)。通

8、過大體解剖和影像學(xué)觀察，了解小鼠股骨形態(tài)結(jié)構(gòu)特點。采用股骨逆行髓內(nèi)針手術(shù)技術(shù)，通過骨折造模架，造成閉合性股骨中段骨折，在股骨髁間切跡向髓腔內(nèi)插入鋼針固定。術(shù)后影像學(xué)和組織學(xué)觀察，證實本研究采用髓內(nèi)釘手術(shù)技術(shù)建立小鼠閉合性股骨骨折模型，其骨折愈合為典型的軟骨內(nèi)骨化。
　　 2.觀察方法
　　 組織學(xué)觀察:脫鈣小鼠股骨骨折標(biāo)本采用番紅O-固綠染色進行組織學(xué)觀察。X線觀察:術(shù)后不同時間點，采用KodakDirectviewDR

9、3500拍攝X線片，確定骨折類型，觀察骨折愈合過程影像學(xué)變化情況。softX-ray觀察:采用GESenographe2000D拍攝股骨骨折標(biāo)本的正位和側(cè)位片，獲得高分辨率影像，分析骨折愈合過程中骨痂大小變化情況，進一步觀察骨折愈合情況。micro-CT觀察:采用廣州中科愷盛醫(yī)療技術(shù)有限公司的ZKKS-MCT-Ⅲmicro-CT進行掃描及數(shù)據(jù)處理，觀察骨折塑型情況。
　　 3.fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究n-3PUFAs對骨折愈

10、合影響的良好工具
　　 來源于小秀麗線蟲(C.elegans)fat-1基因編碼n-3脂肪酸去飽和酶，可將不同的n-6脂肪酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的n-3脂肪酸。哺乳動物缺乏fat-1基因，正常情況下不能合成n-3PUFAs，必需依靠飲食補充。同時，n-3PUFAs的來源是有限的。fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)源性產(chǎn)生n-3PUFAs，各組織中相應(yīng)的n-3PUFAs含量增加，相應(yīng)地n-6PUFAs含量明顯減少，細胞膜n-6/n-3PUFAs比率降低

11、，是研究n-3PUFAs起有益作用的良好工具。因此，我們利用at-1轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型C57BL/6J小鼠對比，研究n-3PUFAs對骨折愈合的影響。實驗小鼠分為2組，F(xiàn)at-1:fat-1基因陽性的小鼠;WT:fat-1基因陰性的小鼠或C57BL/6J小鼠，通過建立小鼠股骨骨折模型來研究內(nèi)源性n-3PUFAs對骨折愈合的影響。
　　 4.外源性AA改變n-6/n-3PUFAs比率
　　 通過喂飼AA油劑，增加n-6/n

12、-3PUFAs比率，或fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)源性降低n-6/n-3PUFAs比率，調(diào)節(jié)AA代謝通路中的底物AA。實驗小鼠分為4組，即C組、C+AA組、F組和F+AA組，C組為C57BL/6J小鼠骨折手術(shù)后每天給予生理鹽水灌胃;C+AA組:C57BL/6J小鼠骨折手術(shù)后每天給予AA油劑灌胃(6g/kg);F組:fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠骨折手術(shù)后每天給予生理鹽水灌胃;F+AA組:fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠骨折手術(shù)后每天給予AA油劑灌胃(6g/kg)。

13、
　　 5.塞來昔布抑制AA代謝通路的環(huán)氧合酶(COX)途徑，減少前列腺素E2(PGE2)產(chǎn)生
　　 AA代謝通路的COX途徑參與骨折愈合中軟骨內(nèi)骨化的調(diào)節(jié)，COX-2抑制劑塞來昔布(celecoxib)，抑制COX途徑，減少PGE2產(chǎn)生。實驗小鼠分為2組，即F組和F+Cel組，F(xiàn)組:fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠骨折手術(shù)后每天給予生理鹽水灌胃;F+Cel組:fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠骨折手術(shù)后每天給予塞來昔布灌胃(50mg/kg)。<

14、br>　　 6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
　　 實驗數(shù)據(jù)均用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。
　　 四、研究結(jié)果:
　　 1.n-3PUFAs通過促進骨折愈合，加速骨痂塑型，對骨折愈合是有益的
　　 與野生型C57BL/6J小鼠(WT)不同，fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠(Fat-1)內(nèi)源性增加n-3PUFAs。骨折愈合早期組織學(xué)觀察表明，F(xiàn)at-1較WT的軟骨細胞成熟肥大、終末期分化和基質(zhì)鈣化更快。與WT相比，F(xiàn)at-1的軟

15、骨內(nèi)骨化和骨折愈合更快，骨痂塑型明顯更好，形成的板層骨更厚。以上組織學(xué)觀察表明，F(xiàn)at-1骨折愈合和骨塑型更早更快。
　　 骨折愈合過程中系列X線觀察顯示，WT分別在術(shù)后21天和28天顯示鈣化骨痂和骨性愈合，而Fat-1提前至術(shù)后18天和21天形成鈣化骨痂和達到骨性愈合，表明Fat-1骨折愈合早期軟骨內(nèi)骨化過程較WT快，提前達到骨性愈合。WT于骨折術(shù)后35天僅顯示有限骨塑型，而Fat-1在骨折術(shù)后35天幾乎完成骨塑型，表明Fat

16、-1骨折塑型較對照組更快更明顯，
　　 softX-ray分析顯示，WT和Fat-1在骨折后14天骨痂直徑均達到最大，隨后逐漸縮小，骨折愈合時間線一致。兩組各選12只小鼠于骨折術(shù)后21天進行softX-ray攝片，進行兩組骨折愈合情況對比分析，再次證實Fat-1骨折愈合較WT更快。
　　 micro-CT骨痂三維重建顯示，骨折后49天，WT骨痂塑型不明顯，體積大，以編織骨為主，而Fat-1骨痂鈣化及骨痂塑型更好，形成完整

17、板層骨，表明Fat-1骨折愈合中軟骨內(nèi)骨化過程較WT快，提前達到骨性愈合，且Fat-1編織骨向板層骨的轉(zhuǎn)化較WT更早更快。
　　 2.n-3PUFAs改變n-6/n-3PUFAs比率，通過AA代謝通路，促進骨折愈合
　　 骨折愈合早期組織學(xué)觀察，通過C+AA組與C組比較、F+AA組與F組比較發(fā)現(xiàn)，外源性AA可促進骨痂中骨髓基質(zhì)細胞增殖，并促進其向軟骨細胞分化，但對軟骨細胞成熟肥大、終末期分化起抑制作用，抑制軟骨內(nèi)骨化。F

18、組與C+AA組比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)組內(nèi)源性減少AA且增加n-3PUFAs，降低n-6/n-3PUFAs比率，可促進軟骨細胞終末期分化、基質(zhì)鈣化，加速軟骨內(nèi)骨化;C+AA組外源性增加AA，增加n-6/n-3PUFAs比率，抑制軟骨細胞成熟肥大、終末期分化、基質(zhì)鈣化，抑制軟骨內(nèi)骨化，表明n-6/n-3PUFAs比率對軟骨內(nèi)骨化起負(fù)調(diào)節(jié)作用。
　　 骨折術(shù)后7、10、14、18、21、28、35天系列X線攝片觀察，以及骨折后21天及49天so

19、ftX-ray觀察，通過C+AA組與C組比較、F+AA組與F組比較發(fā)現(xiàn)，外源性AA可抑制軟骨內(nèi)骨化，減慢骨折愈合和骨痂塑型。F組與C+AA組比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)組內(nèi)源性減少AA且增加n-3PUFAs，降低n-6/n-3PUFAs比率，可加速軟骨內(nèi)骨化和骨塑型，促進骨折愈合;C+AA組外源性增加AA，增加n-6/n-3PUFAs比率，抑制軟骨內(nèi)骨化過程，骨塑型減慢，表明n-6/n-3PUFAs比率對骨折愈合及骨塑型起負(fù)調(diào)節(jié)作用。
　　 骨

20、折后49天micro-CT骨痂三維重建對比觀察，通過C+AA組與C組比較、F+AA組與F組比較發(fā)現(xiàn)，外源性AA可抑制骨痂塑型。F組與C+AA組比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)組內(nèi)源性減少AA且增加n-3PUFAs，降低n-6/n-3PUFAs比率，可加速骨塑型，促進骨折愈合;C+AA組外源性增加AA，增加n-6/n-3PUFAs比率，骨塑型減慢，表明n-6/n-3PUFAs比率對骨塑型起負(fù)調(diào)節(jié)作用。
　　 以上組織學(xué)及影像學(xué)結(jié)果分析表明，n-3PU

21、FAs促進骨折愈合的機制之一，可能通過改變細胞膜n-6/n-3PUFAs比率，減少AA代謝通路的底物AA，從而加速軟骨內(nèi)骨化而促進骨折愈合。n-6/n-3PUFAs比率對軟骨內(nèi)骨化、骨折愈合及骨塑型起負(fù)調(diào)節(jié)作用。
　　 骨折愈合早期組織學(xué)觀察，通過F+Cel組與F組比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)+Cel組中塞來昔布抑制環(huán)氧合酶-2(COX-2)，減少PGE2產(chǎn)生，骨髓基質(zhì)細胞初期分化成軟骨細胞較對照組明顯減少，形成較小骨痂，表明COX途徑在骨折愈

22、合早期軟骨細胞初期分化中起著重要作用。
　　 骨折術(shù)后7、10、14、18、21、28、35天系列X線攝片觀察，骨折后21天及49天softX-ray觀察，以及骨折后49天micro-CT觀察，通過F+Cel組與F組比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)+Cel組塞來昔布對骨折愈合早期軟骨內(nèi)骨化有很明顯的影響，形成骨痂較小，但軟骨細胞終末期分化和基質(zhì)鈣化加快，骨痂塑型好，表明COX途徑對軟骨細胞終末期分化、基質(zhì)鈣化以及骨塑型的影響不大。
　　 以

23、上組織學(xué)及影像學(xué)結(jié)果分析表明，塞來昔布抑制COX-2，減少PGE2產(chǎn)生，骨髓基質(zhì)細胞初期分化成軟骨細胞較對照組明顯減少，形成較小骨痂，對骨折愈合早期軟骨內(nèi)骨化有明顯影響，但對軟骨細胞終末期分化、基質(zhì)鈣化以及骨塑型的影響不大，表明COX途徑參與骨折愈合早期的調(diào)節(jié)。
　　 五、結(jié)論:
　　 1.本研究通過建立小鼠閉合性股骨骨折模型，與野生型小鼠比較發(fā)現(xiàn)，fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)源性產(chǎn)生的n-3PUFAs可促進骨折愈合與骨塑型，

24、表明n-3PUFAs通過加速軟骨內(nèi)骨化而促進骨折愈合與骨塑型，對骨折愈合是有益的。
　　 2.增加AA可增加n-6/n-3PUFAs比率，抑制軟骨內(nèi)骨化，骨塑型減慢，而減少AA或增加n-3PUFAs可降低n-6/n-3PUFAs比率，促進軟骨內(nèi)骨化和骨塑型，表明n-6/n-3PUFAs比率對軟骨內(nèi)骨化、骨折愈合及骨塑型起負(fù)調(diào)節(jié)作用。
　　 3.n-3PUFAs促進骨折愈合的機制之一，是降低細胞膜n-6/n-3PUFAs比