構(gòu)建重組Galectin-9腺病毒及其對(duì)移植小鼠Treg細(xì)胞分化和增殖的影響.pdf

1、近幾十年來(lái)，人們對(duì)蛋白和基因的研究有很大的突破，但是對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于細(xì)胞表面且表達(dá)各異的糖綴合物卻知之不多。Galectin(半乳糖凝集素)是細(xì)胞質(zhì)蛋白，廣泛地分布于細(xì)胞內(nèi)外，可以靶向分泌到細(xì)胞核內(nèi)或在胞漿中，與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的蛋白相互作用，傳導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)，調(diào)節(jié)mRNA的剪切、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞的凋亡?；蛘咄ㄟ^(guò)非經(jīng)典途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體復(fù)合物，釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中，連接細(xì)胞外基質(zhì)中包含β-半乳糖苷的糖綴合物和細(xì)胞表面的黏附因

2、子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和分化。至今已經(jīng)成功克隆了15個(gè)家族成員，Galectin-1及Galectin-3等已研究得較為深入。 Galectin-9是半乳糖結(jié)合蛋白家族的成員之一，屬于動(dòng)物凝集素，能夠與細(xì)胞表面和細(xì)胞間質(zhì)中的半乳糖特異性的結(jié)合，發(fā)揮細(xì)胞之間以及細(xì)胞與間質(zhì)之間的信號(hào)傳遞作用。Galectin-9結(jié)構(gòu)上具有兩個(gè)羰基結(jié)合區(qū)域(CRD)，分子量為36kDa，中間由連接肽連接，具有比較明確的激活嗜紅細(xì)胞，分化單核細(xì)胞的作用。

3、人類(lèi)Galectin-9是在Hodgkin's病人的組織克隆出來(lái)的，并廣泛分布于人體。其生物活性主要介入細(xì)胞黏附，增殖，凋亡，細(xì)胞周期。在免疫反應(yīng)中，可以在T細(xì)胞浸潤(rùn)的組織中不同的細(xì)胞上如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等檢測(cè)到。提示Galectin-9在調(diào)控免疫反應(yīng)中起重要作用。最新文獻(xiàn)提示Galectin-9在數(shù)種腫瘤中有抗轉(zhuǎn)移潛力，例如乳癌，鱗狀細(xì)胞癌。還有報(bào)道Galectin-9可誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。 T細(xì)胞

4、免疫球蛋白粘蛋白3(T cell immunoglobulin mucin3，TIM3)是分化成熟Th1細(xì)胞表達(dá)的分子，而不表達(dá)在Th2細(xì)胞表面，現(xiàn)已證明Galectin-9作為其配體，此途徑已明確是Th1細(xì)胞免疫作用的重要調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的凋亡。且以鼠重組Galectin-9結(jié)合TIM-3可顯著抑制同種異體移植排斥和延長(zhǎng)同種異體皮膚移植的生存。 免疫抑制是通過(guò)免疫抑制劑對(duì)T、B淋巴細(xì)胞的活化、分化好增殖的抑制以及誘導(dǎo)

5、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)的負(fù)向調(diào)節(jié)發(fā)揮抑制免疫系統(tǒng)的作用。CD4+CD25+Tregs亞群具有免疫調(diào)節(jié)功能，是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的主要類(lèi)型，于1995年首次由Sakaguchi等提出。CD4+CD25+Tregs的免疫學(xué)特點(diǎn)是免疫無(wú)反應(yīng)性和免疫抑制性，可以通過(guò)下調(diào)機(jī)體的免疫應(yīng)答維持對(duì)自身和非自身抗原的免疫耐受，CD4+CD25+Tregs數(shù)量低下和功能紊亂可導(dǎo)致多種自身免疫性疾病，另外，它們?cè)谀承?/p>

6、嚴(yán)重的炎癥性疾病和下調(diào)腫瘤免疫應(yīng)答中也起重要作用。CD4+CD25+Tregs以細(xì)胞接觸依賴(lài)性方式抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞。在無(wú)抗原呈遞細(xì)胞出現(xiàn)的情況下仍可發(fā)生抑制現(xiàn)象，說(shuō)明細(xì)胞間接觸方式是在抑制T細(xì)胞與反應(yīng)T細(xì)胞間進(jìn)行的，CD4+CD25+Tregs通過(guò)它們的TCR活化成為抑制性效應(yīng)T細(xì)胞，細(xì)胞一旦激活，其抑制功能是非特異性的，可抑制CD4和CD8T細(xì)胞的活性。CD4+CD25+Tregs還抑制自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞

7、的功能。在人類(lèi)也發(fā)現(xiàn)了Tregs參與免疫耐受的證據(jù)，Tregs升高往往與移植器官功能良好、免疫耐受的出現(xiàn)等呈現(xiàn)正相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3基因參與Treg細(xì)胞的中樞性和外周性生成過(guò)程，并影響Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮。 Galectin-9是半乳糖凝集素之一，誘導(dǎo)嗜酸性細(xì)胞，腫瘤，及T細(xì)胞的凋亡，優(yōu)先誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞凋亡，我們?cè)O(shè)想通過(guò)分析Galectin-9是否能在體能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化和增殖，負(fù)向調(diào)節(jié)發(fā)揮抑制免疫系統(tǒng)

8、的作用，從而影響受體對(duì)移植物的免疫耐受的形成。因此本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建小鼠重組腺病毒載體pAdeasyTM-Galectin-9，經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序鑒定及Westernblot檢測(cè)，結(jié)果顯示，攜帶小鼠Galectin-9基因的腺病毒載體構(gòu)建成功。經(jīng)過(guò)病毒的擴(kuò)增及滴度檢測(cè)，我們構(gòu)建的小鼠pAdeasyTM-Galectin-9腺病毒獲得了較高的滴度。通過(guò)將外源性重組Galectin-9輸入小鼠心臟移植模型體內(nèi)觀察對(duì)移植物生存的影響，并且觀察T

9、reg細(xì)胞的分化，增殖，探討Galectin-9可能誘導(dǎo)免疫耐受的作用提供新的思路。 第一部分 Galectin-9腺病毒載體的構(gòu)建 腺病毒載體因其具有基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、宿主細(xì)胞范圍廣、滴度高、感染效率高、無(wú)插入突變危險(xiǎn)等優(yōu)勢(shì)，因此我們選擇了AdEasyTM Adenoviral Vector System體系構(gòu)建Galectin-9載體。首先取經(jīng)過(guò)LPS刺激4小時(shí)后的小鼠脾臟，抽提其mRNA，然后根據(jù)報(bào)道及Geneban

10、k發(fā)布的基因和蛋白序列，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物，RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增獲得小鼠Galectin-9全長(zhǎng)基因序列，雙酶切后連接到AdEasyTMAdenoviral Vector System體系中的pShuttle-CMV中，然后與pAdeasy-1同源重組，在293A細(xì)胞中包裝出帶有Galectin-9目的基因的腺病毒pAdeasy-Galectin-9。通過(guò)PCR、酶切、測(cè)序鑒定及Westernblot檢測(cè)，結(jié)果

11、顯示，攜帶小鼠Galectin-9基因的腺病毒載體可高表達(dá)Galectin-9蛋白，說(shuō)明帶有目的基因Galectin-9的腺病毒構(gòu)建成功。經(jīng)過(guò)病毒的擴(kuò)增及滴度檢測(cè)，我們構(gòu)建的小鼠pAdeasy- Galectin-9腺病毒獲得了較高的滴度。 第二部分重組 Galectin-9腺病毒對(duì)小鼠心臟移植模型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖的影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的：通過(guò)觀察重組Galectin-9腺病毒、空病毒及對(duì)照組生理鹽水對(duì)小鼠異位心臟移植術(shù)

12、后移植心臟生存時(shí)間、脾臟CD4+CD25+Treg細(xì)胞增殖情況和Foxp3的表達(dá)的影響，探討Galectin-9誘導(dǎo)免疫耐受的可能性及其機(jī)制。 方法：應(yīng)用Cuff法建立雄性BALB/C→C57BL/10小鼠頸部異位心臟移植模型，根據(jù)術(shù)后用藥情況，受體分為3組(n=10)；對(duì)照組(術(shù)后用生理鹽水)、空病毒組、重組Galectin-9腺病毒治療組。記錄移植心臟生存時(shí)間，于移植心停搏或術(shù)后14d取脾，分離單個(gè)核細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)C

13、D4+CD25+Treg細(xì)胞。半定量RT-PCR檢測(cè)Foxp3mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：與對(duì)照組比較，重組Galectin-9腺病毒組明顯提高移植心臟的生存時(shí)間(p＜0.01)，空病毒組在延長(zhǎng)生存時(shí)間方面與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(p＞0.05)；與對(duì)照組比較，重組Galectin-9腺病毒組CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+ T細(xì)胞比例明顯升高(12.20％ vs7.35％，p＜0.01)，空病毒組CD4+CD25+Treg

14、細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例無(wú)明顯差異(6.90％vs7.35％，p＞0.05)；重組Galectin-9腺病毒組T細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)；空病毒組T細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(p＞0.05)。 結(jié)論：小鼠心臟移植后使用重組腺病毒Galectin-9明顯提高了移植心臟的生存期，小鼠心臟移植后使用空病毒與對(duì)照組生理鹽水比較對(duì)提高移植心臟的生存期無(wú)明顯影響，重組腺病毒Galec