重組腺病毒Ad5-Notch1對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、重組腺病毒Ad5Notch1對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響中文摘要目的：1探討外源性Notch1基因轉(zhuǎn)染入MCF7(乳腺癌細(xì)胞)細(xì)胞后的表達(dá)情況；2Notch1基因過表達(dá)對MCF7細(xì)胞增殖的影響。方法：1從人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)PCR獲取Notchi目的基因胞內(nèi)區(qū)全長，PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI與EcoRI雙酶切，用T4DNA連接酶將PGEMT—easy載體與上述酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DHQ5，37。C

2、恒溫?fù)u床過夜，挑菌落，提質(zhì)粒，酶切鑒定，送檢測序。2重組質(zhì)粒PGEMT—NICD通過AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后共感染乳腺癌MCF一7細(xì)胞。3采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR法與Westernblotting蛋白檢測法檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒前后Notch1基因與蛋白的表達(dá)情況。4采用MTT比色法試劑盒分析Notchl過表達(dá)對MCF7細(xì)胞增殖的影響。5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSSl70統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xS)表示，組

3、間比較用t檢驗(yàn)，P005為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)PCR擴(kuò)增獲得了23kb的目的基因片段，測序結(jié)果與GENEBANK中Notchl基因序列一致。成功構(gòu)建真和表達(dá)載體PGEMTNICD，并且經(jīng)BamHI與EcoRI雙酶切可得到5Okb與23kb的兩條基因片段，在此經(jīng)酶切法證明重組載體構(gòu)建正確。2重組腺病毒Ad5一NICD感染MCF一7細(xì)胞后，Notchl基因與蛋白表達(dá)均較未轉(zhuǎn)染組明顯增加(P005)。3重組腺病毒Ad5一NIC

4、D感染MCF一7細(xì)胞后，MTT比色法檢測感染組與未感染組比較，細(xì)胞增殖抑制率下降(P005)。結(jié)論：1Notchl基因?qū)肴橄侔┘?xì)胞MCF一7可測得Notchl基因及相關(guān)蛋白的高表達(dá)。2Notchl基因的過表達(dá)可以明顯增強(qiáng)MCF一7細(xì)胞的增殖能力。乳腺癌：Notchl基因；細(xì)胞增殖；腺病毒碩士研究生：路揚(yáng)勇(普外科)指導(dǎo)教師：王海波教授目錄弓I言00000DOQOOIO1第一章實(shí)驗(yàn)材料21實(shí)驗(yàn)儀器22細(xì)胞株23主要試劑24溶液配制341

5、細(xì)胞培養(yǎng)及增殖測定相關(guān)試劑342RT—PCR試劑所需343感受態(tài)細(xì)胞的制備444WesternBlot試劑的配制445實(shí)驗(yàn)耗材及其它OOIODIOQOOIQI5第二章試驗(yàn)方法OOOOOO611U251細(xì)胞的培養(yǎng)612提取RNA所用器皿與電泳槽的處理613總RNA的提取614總RNA的定量及純度檢測715cDNA的合成716NotchlNICD基因全長擴(kuò)增7161NotchlNICD上游片段的合成OOQOOOOIO008162Notchl

6、NICD下游片段的合成9163NotchlNICD全長片段的合成917PCR產(chǎn)物的回收1018Notchl基因胞內(nèi)段NICD與PGEMT—easy載體的連接1l19連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞1220單克隆菌落挑取一1221質(zhì)粒提取1222質(zhì)粒酶切及測序1323重組腺病毒的包裝1324重組腺病毒感染乳腺癌細(xì)胞MCF71425WesternBlot檢測轉(zhuǎn)染前后NICD蛋白水平變化1426MTT法檢測細(xì)胞增殖狀況1527實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測15