HSP70與P38在A549細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 目前，對(duì)于肺癌發(fā)病機(jī)制的研究，以及一些針對(duì)肺癌的某些抗腫瘤療法的建立，正逐漸成為生命科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　 有研究表明，熱休克蛋白70(heatshockprotein70，HSP70)可以通過調(diào)節(jié)應(yīng)激激活的P38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)通路來增加組織細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)性，但是其作用機(jī)制尚不明確。為此，本研究采用放線菌素D作為誘導(dǎo)劑作用

2、于人肺腺癌細(xì)胞株(A549細(xì)胞)，建立相關(guān)的細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡模型。繼而利用A549細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡模型，檢測各組細(xì)胞的HSP70、p-P38、Caspase3等3組蛋白的表達(dá)以及早期凋亡情況。初步探討HSP70通過P38MAPK通路進(jìn)一步調(diào)控A549細(xì)胞凋亡的可能作用機(jī)制，進(jìn)而為通過阻斷HSP70的抗凋亡作用來治療腫瘤這一方案提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.ActD的染毒濃度:
　　 待A549細(xì)胞長滿

3、后，采用MTT法檢測ActD對(duì)A549細(xì)胞的染毒濃度。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組:
　　 采用放線菌素D(actinomycinD，ActD)作為凋亡誘導(dǎo)劑，將A549細(xì)胞分為5個(gè)組，分別為:①空白對(duì)照組;②SB203580組;③SB203580+ActD組;④熱處理+ActD組⑤ActD組。其中SB203580為P38MAPK通路的抑制劑;熱休克條件為42℃水浴，0.5h。
　　 3.Westernblot法檢測各目

4、的蛋白的表達(dá)情況:
　　 待各組細(xì)胞長滿整個(gè)細(xì)胞瓶后，使用哺乳動(dòng)物蛋白抽提劑提取各組細(xì)胞的總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定各組細(xì)胞總蛋白濃度。隨之，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗與二抗孵育、顯色、成像，得出結(jié)果。最后，使用Quantityone軟件分析HSP70蛋白、p-P38蛋白以及Caspase3蛋白等3種目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　 4.AcuuriC6檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞早期凋亡率:
　　 將處理后的各組細(xì)胞，消化，離心，Ann

5、exinV-FITC和碘化丙碇雙染法對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色，制成細(xì)胞懸液，避光靜置15min后，檢測各組細(xì)胞的早期凋亡率。
　　 5.實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。應(yīng)用SPSS12.0軟件對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組之間的差異性比較采用單因素方差分析;獨(dú)立樣本兩兩比較采用LSD法，檢測水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.Westernblot檢測HSP70、p-P38和Caspase

6、3等3種蛋白的表達(dá)情況:
　　 ①HSP70的表達(dá)情況:
　　 與空白對(duì)照組相比，SB203580組、SB203580+ActD、熱處理+ActD、ActD組的HSP70的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。
　　 與ActD組相比，熱處理+ActD組HSP70表達(dá)量上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 ②p-P38的表達(dá)情況:
　　 與空白對(duì)照組相比，SB203580組

7、、熱處理+ActD組p-P38的表達(dá)量均下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);ActD組的p-P38的表達(dá)量上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。
　　 與ActD組相比，SB203580+ActD組、熱處理+ActD的p-P38表達(dá)量均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 ③Caspase3的表達(dá)情況:
　　 與空白對(duì)照組相比，SB203580、SB203580+ActD、熱處理+ActD組Cas

8、pase3的表達(dá)量均下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);ActD處理組Caspase3的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。
　　 與ActD組相比，SB203580+ActD組、熱處理+ActD組Caspase3的相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 2.各組細(xì)胞早期凋亡率結(jié)果:
　　 與空白對(duì)照組相比，SB203580組、SB203580+ActD組、熱處理+ActD組