H9N2亞型豬流感病毒M1、NS1、NP基因的原核表達和NP-ELISA檢測技術(shù)的研究.pdf

1、豬流感(Swine influenza，SI)是由豬流感病毒(Swine influenza，virus，SIV)引起的不同日齡、性別和品種豬的一種急性、熱性和高度接觸性的呼吸道傳染病。其特征為疾病突發(fā)，高熱，精神沉郁，食欲廢絕，呼吸困難，陣發(fā)性咳嗽。SI的病死率不高，病豬可迅速康復(fù)，但是隨著集約化養(yǎng)豬規(guī)模的不斷擴大，SI對養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了較大的威脅。1918年美國首次報道了SI的暴發(fā)，1930年Shope從豬體中分離到了H1Nl亞型SIV

2、。迄今為止，SI已遍布美、歐、亞、非等世界各地。SI除具有獸醫(yī)學(xué)意義外，更為重要的是生態(tài)學(xué)和公共衛(wèi)生意義。目前，SI已成為研究的熱點。研究快速、科學(xué)、準確的診斷方法對于本病的檢測和控制具有很大的意義。 本研究用接種雞胚的病毒增殖方法大量增殖分離株A/swine/Hangzhou/1/2006(I{9N2)，增殖病毒經(jīng)差速離心進行純化，經(jīng)超速離心濃縮。根據(jù)Genbank發(fā)表的SIV結(jié)構(gòu)蛋白M1、NP和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因核苷酸序列

3、，設(shè)計1條通用引物Unit，進行反轉(zhuǎn)錄獲取eDNA；設(shè)計特異性引物Pm1/Pm2、Pnp1/Pnp2、Pns1/Pns2用以擴增M1、NP和NS1基因。通過PCR技術(shù)，從病毒基因反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA中擴增出病毒結(jié)構(gòu)蛋白M1、NP和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1目的基因片段，將其克隆到pMD18-T載體，然后定向克隆到表達載體pET-28a中。提取重組質(zhì)粒經(jīng)PCR．鑒定和酶切鑒定后，對插入片段進行序列測定及分析。將重組質(zhì)粒pET-M1，pET-NS1和p

4、ET-NP轉(zhuǎn)化到表達宿主菌BL21(DE3)/Rosetta<'TM>(DE3)中，經(jīng)終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，高效表達了M1、NP和NS1蛋白，分子質(zhì)量約為31.4 kD、55.1kD和27kD。經(jīng)Western-Blot檢測表明，表達的重組蛋白均能夠被SIV陽性血清所識別，具有良好的抗原性。此結(jié)果為SI新型免疫學(xué)診斷試劑以及亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。 用純化的H9N2亞型SI可溶重組NP蛋白作為包被抗原，建立

5、了檢測SI抗體的間接ELISA方法，并確定了ELISA最佳工作條件：抗原包被濃度為12.5μg/ml，37℃1h加4℃過夜，血清(1：40)和SPA(1：10000)分別在37℃溫育40 min，底物溶液37℃顯色15 min。經(jīng)重復(fù)性試驗、交叉試驗、競爭抑制試驗等試驗結(jié)果表明該方法重復(fù)性好、特異性強、靈敏度高；利用’rG．ROC軟件確定了自制ELISA(NP-ELISA)酶標(biāo)板的臨界值為0.20，特異性和敏感性分別為95.83％和91