大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣后縫隙連接形態(tài)學(xué)檢測.pdf

1、目的:
　　成功建立大鼠SAH后CVS模型，利用印度墨汁染色腦血管澆鑄實(shí)驗(yàn)法測定和對比腦基底動(dòng)脈直徑的改變。應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡、電鏡等技術(shù)觀察大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血腦血管痙攣前后腦基底動(dòng)脈各層中Cx43和Cx40表達(dá)的改變及其縫隙連接超微結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)一步探討大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣發(fā)生機(jī)制及其縫隙連接在其中可能發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　1、選以成年SD大鼠（南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)部提供）作為模型動(dòng)物，采用經(jīng)

2、枕大池二次注血建立蛛網(wǎng)膜下腔出血腦血管痙攣模型實(shí)驗(yàn)方法。
　　2、CVS模型檢測:采用腦血管澆鑄法分別測定正常組和SAH3d、7d、14d組大鼠基底動(dòng)脈直徑來證實(shí)腦血管痙攣(CVS)的存在。
　　3、本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀測縫隙連接蛋白Cx43和Cx40在腦基底動(dòng)脈管壁各層分布情況，應(yīng)用程序圖象對將其所得數(shù)字化圖像進(jìn)行計(jì)算機(jī)中進(jìn)行處理分析。對縫隙連接蛋白Cx40和Cx43像素密度和其熒光斑面積的大小的進(jìn)行準(zhǔn)確測定，

3、并將應(yīng)用所獲得的圖像素密度和熒光斑面積大小來代表Cx40和Cx43的數(shù)量，從而達(dá)到對其進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析目的。
　　4、應(yīng)用掃描電鏡和超薄切片研究方法觀察大鼠SAH后腦血管痙攣前后縫隙連接(GJ)的形態(tài)學(xué)特征。
　　結(jié)果:
　　1、實(shí)驗(yàn)過程中大鼠的死亡率18％左右，大多數(shù)死亡均發(fā)生在首次枕大池穿刺造模和二次枕大池穿刺注血造模時(shí)。成功建立大鼠可靠蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后腦血管痙攣(CVS)動(dòng)物模型，成功建模后的大鼠出現(xiàn)不

4、同程度的肢體癱瘓、不能正常行走、精神萎靡、畏光、卷縮等表現(xiàn)。成功造模后顱內(nèi)SAH血凝塊大部分分布在基底池、環(huán)池、端腦表面溝回、鞍上池等處。大多數(shù)大鼠48小時(shí)后行二次經(jīng)枕大池注血造模穿刺時(shí)即可見穿刺針頭發(fā)現(xiàn)有血性腦脊液流出，這也間接說明SAH模型制造成功，成功率一般均≥92％上。
　　2、利用腦血管澆鑄法分別測定正常組和SAH3d、7d、14d組大鼠基底動(dòng)脈直徑來證實(shí)腦血管痙攣(CVS)的發(fā)生;與正常組相比較，SAH3d、7d組大鼠

5、基地動(dòng)脈直徑明顯縮小、可見管壁不同程度增厚，而14d組中大鼠腦基底動(dòng)脈直徑變化不明顯更接近正常組。
　　3、a、正常大鼠組中在腦基底動(dòng)脈內(nèi)皮、血管外膜和平滑肌層表達(dá)少見上主要以表達(dá)Cx43為主。b、當(dāng)CVS后CVS大鼠腦基底動(dòng)脈Cx43在平滑肌中表達(dá)明顯增加。c、正常情況下Cx40主要存在于平滑肌層，但CVS后Cx40平滑肌中表達(dá)亦增加但不如Cx43增加明顯。
　　4、電鏡下可見正常組中大鼠腦基底動(dòng)脈血管呈典型的三層結(jié)構(gòu)（外

6、膜層、梭型平滑肌層和平滑的內(nèi)膜層）排列整齊;大鼠基底動(dòng)脈單層扁平狀血管內(nèi)皮細(xì)胞光滑，層次排列正常、管壁無增厚、余無異常改變。連續(xù)單層覆蓋于內(nèi)彈力上，細(xì)胞核呈錘狀，細(xì)胞核膜邊緣清晰;外膜細(xì)胞核梭形、光滑。而在SAH實(shí)驗(yàn)組大鼠基底動(dòng)脈管壁檢測到了陽性的病理性改變:SAH后第3、7和14天分別均可見血凝塊附著，管壁內(nèi)皮細(xì)胞變性、核固縮、細(xì)胞之間融合、部分甚至壞死、脫落、細(xì)胞間隙增寬;內(nèi)彈力膜層增厚，線粒體變形，平滑肌細(xì)胞缺乏典型的梭形形態(tài)，彈

7、力纖維層扭曲變形消失、細(xì)胞外膜增厚，以上各細(xì)胞之間以及細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)有縫隙連接存在。
　　本研究還發(fā)現(xiàn)無論正常組還是異常組血管外膜、內(nèi)皮細(xì)胞之間和平滑肌細(xì)胞三層細(xì)胞之間都存在縫隙連接，但有意義的是SAH時(shí)這些縫隙連接通道的數(shù)量明顯增加。
　　結(jié)論:
　　1、SAH后CVS的發(fā)生與腦血管的病理改變持續(xù)存在密切相關(guān);
　　2、正常情況下Cx43主要分布在細(xì)胞內(nèi)皮和血管外膜而Cx40主要在血管平滑肌層表達(dá);
　　3、