大鼠蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣及HIF-1α和VEGF表達的研究.pdf

1、蛛網膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)多由動脈瘤破裂出血引起。腦血管痙攣(Cerebral vasospasm，CVS)是蛛網膜下腔出血常見和嚴重的并發(fā)癥，發(fā)生率高達70％，常引起嚴重的局部腦組織缺血或遲發(fā)性腦損傷，甚至導致腦梗死，成為致死或重殘的主要原因。目前普遍認為SAH后血液彌散至蛛網膜下腔導致了腦血管痙攣和缺血性神經功能的障礙，但是對SAH后CVS的病理生理機制沒有完全研究清楚。對于腦缺血機制的

2、研究主要集中在大血管痙攣方面，但是這種腦血管痙攣不能完全解釋遲發(fā)性腦缺血的神經功能障礙，大腦微動脈的障礙可能在SAH后的腦缺血中起了重要的作用。然而，SAH后大腦微循環(huán)的改變存在爭議。 缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是機體缺氧適應過程中起核心調控作用的因子，它通過調節(jié)靶基因的轉錄蛋白在組織氧傳遞，血管生成，能量代謝方面發(fā)揮作用。血管內皮細胞生長因子(Vascular e

3、ndothelial growth factors，VEGF)是體內促進血管新生最重要的因子，可促進血管內皮細胞增生、遷移及增加血管通透性，VEGF在降低大腦慢性缺血性損傷，促進側枝循環(huán)的建立，減小腦梗塞面積方面起著重要的作用。但是HIF-1α和VEGF在蛛網膜下腔出血后大腦皮層中的表達鮮見報道。 目的：通過建立血管內穿刺法大鼠蛛網膜下腔出血模型，應用光鏡和透射電鏡(transmission electron microscop

4、y，TEM)觀察模型組不同時相的大腦皮層神經元及微血管的病理形態(tài)學及超微結構的變化特點，為研究CVS的發(fā)生機制提供形態(tài)學資料。通過免疫組織化學染色觀察HIF-1α和VEGF的在大鼠的SAH模型中的表達情況，探討HIF-1α和VEGF在SAH中的表達規(guī)律，以及其表達與形態(tài)學變化之間的關系，為臨床預防與治療SAH后CVS提供實驗依據(jù)。 方法： 1.成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠55只，體重260-280g。隨機

5、分為3組，正常組5只，假手術組5只，手術組45只，按造模時間再分為術后1h、3h、6h、9h、12h、24h、48h、5d、7d組共9組，每組各5只。手術組采用血管內穿刺法制作SAH模型，假手術組僅做血管內穿刺，不刺破大腦前動脈與大腦中動脈分叉。 2.各組動物麻醉后，經左心室灌注多聚甲醛固定后取腦。觀察各組腦組織的大體形態(tài)，各組蛛網膜下腔血液分布情況。光鏡觀察腦組織病理學變化，透射電鏡觀察大腦皮層及微血管的超微結構變化。

6、 3.應用SP法行HIF-1α和VEGF免疫組織化學染色，應用專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus 5.0(Media Cybernetics公司，美國)測定陽性細胞染色的平均光密度值(MOD)來表示抗原表達量。 4.應用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-T檢驗，相關分析采用Pearson相關分析，以P<0.05表示

7、差異有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.腦組織大體觀手術組：術后1h可見頸動脈池、視交叉池和基底池明顯積血，大腦凸面蛛網膜下腔少量積血。3-24h組可見蛛網膜下腔的積血由腦底面向腦表面擴散，大腦凸面蛛網膜下腔血液彌散范圍逐漸增大，48h后腦凸面及顱底面的蛛網膜下腔的血液較前減少，第四腦室可見明顯積血。5d組僅基底池可見少量血凝塊。7d組蛛網膜下腔的血液基本消失。正常組和假手術組開顱未見蛛網膜下腔有血液。 2.組織形態(tài)學觀

8、察手術組：神經元和血管內皮細胞的形態(tài)結構的改變主要是大腦皮層神經元變性腫脹，腦水腫。微血管周圍間隙稍增寬。在SAH后3h可發(fā)現(xiàn)形態(tài)結構的改變，SAH后24h到48h腦組織水腫達到高峰。正常對照組及假手術組：腦組織神經元結構基本正常。 3.大腦皮層及微血管的超微結構觀察手術組：神經元和血管內皮細胞的超微結構的改變主要是細胞核內染色質邊集、濃縮，異染色質增多，胞質內線粒體腫脹、嵴紊亂、溶解呈空泡，粗面內質網擴張，脫顆?，F(xiàn)象。血管內皮

9、細胞間緊密連接消失，細胞核內染色質濃縮，線粒體腫脹、嵴紊亂，管腔狹窄甚至閉塞。在SAH后1h時可發(fā)現(xiàn)超微結構的改變，從6h開始明顯的結構改變，在12h至48h結構變化最明顯。正常對照組及假手術組：神經元及血管內皮細胞未見異常。 4.HIF-1α蛋白在SAH大鼠大腦皮層中的表達實驗組于1h、3h大腦皮層神經元開始出現(xiàn)少量的HIF-1α的陽性表達，但與對照組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SAH 6h組的HIF-1α的陽性表達逐漸

10、增加，其與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HIF-1α的陽性表達24h達到高峰并且持續(xù)高表達至48h后逐漸下降。7d組的HIF-1α的陽性表達與對照組比較差別無顯著性(P>0.05)。假手術組與正常組偶見HIF-1α陽性表達，二者比較差別無顯著性(P>0.05)。 5.VEGF蛋白在SAH大鼠大腦皮層中的表達實驗組在1h組大腦皮層VEGF的陽性表達有短暫的升高后，3h，6h組的表達明顯降低。9h組VEGF的表達又開始逐漸

11、增高，其與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。24h達到高峰，并且持續(xù)高表達至48h后逐漸下降，7d組VEGF的陽性表達的，與對照組比較差別無顯著性(P>0.05)。假手術組與正常組偶見VEGF陽性表達，二者比較差別無顯著性(P>0.05)。 6.SAH大鼠大腦皮層中HIF-1α及VEGF蛋白表達相關分析統(tǒng)計學分析表明HIF-1α與VEGF在SAH后大腦皮層神經元的表達均呈正相關，相關系數(shù)r=0.804，且P<0.05，相關

12、有統(tǒng)計學意義。 結論： 1.本實驗采用血管穿刺法建立大鼠SAH模型，動態(tài)觀察蛛網膜下腔的積血分布特點，大腦皮層神經元及微血管的病理形態(tài)學和超微結構的變化特點說明造模是成功的，血管穿刺法是制作SAH較為理想的模型。 2.SAH后微血管內皮細胞的損傷可能是SAH后微循環(huán)障礙的始動因素，局部微循環(huán)功能的障礙可能是造成SAH后缺血性神經功能損害的直接原因。 3.SAH后大腦皮層神經元的HIF-1α和VEGF表達明