大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣及HIF-1α和VEGF表達(dá)的研究.pdf

1、蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)多由動(dòng)脈瘤破裂出血引起。腦血管痙攣(Cerebral vasospasm，CVS)是蛛網(wǎng)膜下腔出血常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)生率高達(dá)70％，常引起嚴(yán)重的局部腦組織缺血或遲發(fā)性腦損傷，甚至導(dǎo)致腦梗死，成為致死或重殘的主要原因。目前普遍認(rèn)為SAH后血液彌散至蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)致了腦血管痙攣和缺血性神經(jīng)功能的障礙，但是對(duì)SAH后CVS的病理生理機(jī)制沒有完全研究清楚。對(duì)于腦缺血機(jī)制的

2、研究主要集中在大血管痙攣方面，但是這種腦血管痙攣不能完全解釋遲發(fā)性腦缺血的神經(jīng)功能障礙，大腦微動(dòng)脈的障礙可能在SAH后的腦缺血中起了重要的作用。然而，SAH后大腦微循環(huán)的改變存在爭(zhēng)議。 缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是機(jī)體缺氧適應(yīng)過程中起核心調(diào)控作用的因子，它通過調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄蛋白在組織氧傳遞，血管生成，能量代謝方面發(fā)揮作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular e

3、ndothelial growth factors，VEGF)是體內(nèi)促進(jìn)血管新生最重要的因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移及增加血管通透性，VEGF在降低大腦慢性缺血性損傷，促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)的建立，減小腦梗塞面積方面起著重要的作用。但是HIF-1α和VEGF在蛛網(wǎng)膜下腔出血后大腦皮層中的表達(dá)鮮見報(bào)道。 目的：通過建立血管內(nèi)穿刺法大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，應(yīng)用光鏡和透射電鏡(transmission electron microscop

4、y，TEM)觀察模型組不同時(shí)相的大腦皮層神經(jīng)元及微血管的病理形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化特點(diǎn)，為研究CVS的發(fā)生機(jī)制提供形態(tài)學(xué)資料。通過免疫組織化學(xué)染色觀察HIF-1α和VEGF的在大鼠的SAH模型中的表達(dá)情況，探討HIF-1α和VEGF在SAH中的表達(dá)規(guī)律，以及其表達(dá)與形態(tài)學(xué)變化之間的關(guān)系，為臨床預(yù)防與治療SAH后CVS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠55只，體重260-280g。隨機(jī)

5、分為3組，正常組5只，假手術(shù)組5只，手術(shù)組45只，按造模時(shí)間再分為術(shù)后1h、3h、6h、9h、12h、24h、48h、5d、7d組共9組，每組各5只。手術(shù)組采用血管內(nèi)穿刺法制作SAH模型，假手術(shù)組僅做血管內(nèi)穿刺，不刺破大腦前動(dòng)脈與大腦中動(dòng)脈分叉。 2.各組動(dòng)物麻醉后，經(jīng)左心室灌注多聚甲醛固定后取腦。觀察各組腦組織的大體形態(tài)，各組蛛網(wǎng)膜下腔血液分布情況。光鏡觀察腦組織病理學(xué)變化，透射電鏡觀察大腦皮層及微血管的超微結(jié)構(gòu)變化。

6、 3.應(yīng)用SP法行HIF-1α和VEGF免疫組織化學(xué)染色，應(yīng)用專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus 5.0(Media Cybernetics公司，美國(guó))測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞染色的平均光密度值(MOD)來表示抗原表達(dá)量。 4.應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-T檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05表示

7、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.腦組織大體觀手術(shù)組：術(shù)后1h可見頸動(dòng)脈池、視交叉池和基底池明顯積血，大腦凸面蛛網(wǎng)膜下腔少量積血。3-24h組可見蛛網(wǎng)膜下腔的積血由腦底面向腦表面擴(kuò)散，大腦凸面蛛網(wǎng)膜下腔血液彌散范圍逐漸增大，48h后腦凸面及顱底面的蛛網(wǎng)膜下腔的血液較前減少，第四腦室可見明顯積血。5d組僅基底池可見少量血凝塊。7d組蛛網(wǎng)膜下腔的血液基本消失。正常組和假手術(shù)組開顱未見蛛網(wǎng)膜下腔有血液。 2.組織形態(tài)學(xué)觀

8、察手術(shù)組：神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變主要是大腦皮層神經(jīng)元變性腫脹，腦水腫。微血管周圍間隙稍增寬。在SAH后3h可發(fā)現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，SAH后24h到48h腦組織水腫達(dá)到高峰。正常對(duì)照組及假手術(shù)組：腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常。 3.大腦皮層及微血管的超微結(jié)構(gòu)觀察手術(shù)組：神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的改變主要是細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集、濃縮，異染色質(zhì)增多，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、嵴紊亂、溶解呈空泡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，脫顆?，F(xiàn)象。血管內(nèi)皮

9、細(xì)胞間緊密連接消失，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，線粒體腫脹、嵴紊亂，管腔狹窄甚至閉塞。在SAH后1h時(shí)可發(fā)現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的改變，從6h開始明顯的結(jié)構(gòu)改變，在12h至48h結(jié)構(gòu)變化最明顯。正常對(duì)照組及假手術(shù)組：神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細(xì)胞未見異常。 4.HIF-1α蛋白在SAH大鼠大腦皮層中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組于1h、3h大腦皮層神經(jīng)元開始出現(xiàn)少量的HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)，但與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SAH 6h組的HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)逐漸

10、增加，其與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)24h達(dá)到高峰并且持續(xù)高表達(dá)至48h后逐漸下降。7d組的HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)與對(duì)照組比較差別無顯著性(P>0.05)。假手術(shù)組與正常組偶見HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)，二者比較差別無顯著性(P>0.05)。 5.VEGF蛋白在SAH大鼠大腦皮層中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組在1h組大腦皮層VEGF的陽(yáng)性表達(dá)有短暫的升高后，3h，6h組的表達(dá)明顯降低。9h組VEGF的表達(dá)又開始逐漸

11、增高，其與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。24h達(dá)到高峰，并且持續(xù)高表達(dá)至48h后逐漸下降，7d組VEGF的陽(yáng)性表達(dá)的，與對(duì)照組比較差別無顯著性(P>0.05)。假手術(shù)組與正常組偶見VEGF陽(yáng)性表達(dá)，二者比較差別無顯著性(P>0.05)。 6.SAH大鼠大腦皮層中HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明HIF-1α與VEGF在SAH后大腦皮層神經(jīng)元的表達(dá)均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.804，且P<0.05，相關(guān)

12、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)采用血管穿刺法建立大鼠SAH模型，動(dòng)態(tài)觀察蛛網(wǎng)膜下腔的積血分布特點(diǎn)，大腦皮層神經(jīng)元及微血管的病理形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化特點(diǎn)說明造模是成功的，血管穿刺法是制作SAH較為理想的模型。 2.SAH后微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可能是SAH后微循環(huán)障礙的始動(dòng)因素，局部微循環(huán)功能的障礙可能是造成SAH后缺血性神經(jīng)功能損害的直接原因。 3.SAH后大腦皮層神經(jīng)元的HIF-1α和VEGF表達(dá)明