利用特異性S2-R2引物鑒定動(dòng)物組織、人石蠟切片和臨床皮損中的孢子絲菌.pdf

1、申克氏孢子絲菌是孢子絲菌病的致病菌，主要引起皮膚，皮下組織和附近淋巴系統(tǒng)的亞急性和慢性感染，偶爾可以播散至骨骼和內(nèi)臟，甚至誘發(fā)全身的播散性感染。本病在我國(guó)東北較為多發(fā)，可在流行區(qū)成批發(fā)生，危害人民健康。目前該病的診斷較為困難。真菌培養(yǎng)，不僅耗時(shí)(約一周)，且陽(yáng)性率不高；組織病理為非特異性肉芽腫性炎癥，組織內(nèi)病原學(xué)診斷仍只限于HE和PAS染色，但因菌量少，常規(guī)組織學(xué)方法很難發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，學(xué)者們?cè)谠摬〉脑\斷研究中進(jìn)行了多方面的探索，包括血清

2、學(xué)檢測(cè)、免疫熒光抗體、免疫病理及電鏡技術(shù)。血清學(xué)檢測(cè)因特異性問(wèn)題而未能延續(xù)；免疫熒光抗體與免疫病理技術(shù)的應(yīng)用，雖然提高了診斷速度，卻因抗體不易標(biāo)準(zhǔn)化、病理存在非特異染色等問(wèn)題而限制其應(yīng)用；電鏡由于操作復(fù)雜，視野小很難發(fā)現(xiàn)病原菌而無(wú)法推廣。我們課題組曾以50株不同地區(qū)來(lái)源的孢子絲菌臨床分離株及標(biāo)準(zhǔn)株的基因組DNA作為研究樣本，以毛霉、煙曲霉、念珠菌臨床分離菌株基因組DNA作為對(duì)照，通過(guò)特異引物PCR擴(kuò)增的方法篩選國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中報(bào)道的4對(duì)孢子

3、絲菌引物S2-R2、SSHF31-SSHR97、ITS3-SSP、SS3-SS4結(jié)果表明針對(duì)幾丁質(zhì)合成酶基因I的引物S2-R2最特異且敏感。 目的： 本研究將以感染孢子絲菌的動(dòng)物模型為研究樣本，進(jìn)一步對(duì)4對(duì)引物進(jìn)行篩選，并將獲得的特異而又敏感的引物用于石蠟切片及臨床活檢標(biāo)本的孢子絲菌檢測(cè)，以達(dá)到從基因水平對(duì)孢子絲菌病進(jìn)行準(zhǔn)確、快速診斷的目的，為盡早治療提供依據(jù)，也可減少因誤診誤治而造成的損失。 材料和方法：

4、 (1) 12只小鼠隨機(jī)分成試驗(yàn)及對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組皮內(nèi)注射孢子絲菌菌懸液，并于不同時(shí)間留取皮損組織，分別進(jìn)行真菌培養(yǎng)和皮損組織DNA提取，PCR擴(kuò)增。比較不同引物的敏感性和特異性。 (2)取30例大連及10例長(zhǎng)春地區(qū)臨床疑診孢子絲菌病、組織病理示感染性肉芽腫的石蠟切片標(biāo)本，采用改良的微波脫蠟、液氮研磨-CTAB破壁法提取孢子絲菌DNA，以我們篩選獲得的孢子絲菌特異而又敏感的S2-R2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠中

5、電泳，紫外燈下觀察，與真菌培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。 (3)10例臨床疑診孢子絲菌病患者，在病理活檢時(shí)獲取0.4×0.8CM2皮損，平分皮損組織分別用于傳統(tǒng)的真菌學(xué)鑒定(真菌培養(yǎng)，組織病理)及PCR檢測(cè)。皮損經(jīng)鈍刀去除雜質(zhì)后勻漿，離心取下層沉淀，以微量提取法(液氮研磨--CTAB法)提取其中的真菌DNA，以特異性S2-R2作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察。 結(jié)果： 1.4對(duì)引物S2-R

6、2，SSHF31-SSHR97，ITS3-SSP，SS3-SS4在感染孢子絲菌的小鼠皮損中均可擴(kuò)增出目的條帶，但引物SSHF31-SSHR97所需濃度較高，與在體外培養(yǎng)條件下篩試的結(jié)果相同，引物S2-R2為最敏感和特異的引物。 2.30例初診疑是孢子絲菌病的石蠟標(biāo)本中PCR擴(kuò)增陽(yáng)性為22例，陽(yáng)性率為73.33％。真菌培養(yǎng)陽(yáng)性為22例。在22例真菌培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本中有20例PCR出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，陽(yáng)性率為91％。8例真菌培養(yǎng)為陰性的標(biāo)本

7、中有2例PCR．出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，陽(yáng)性率為25％。10 例長(zhǎng)春地區(qū)的標(biāo)本中PCR陽(yáng)性為7例，陽(yáng)性率為70％。毛霉、煙曲霉、念珠菌病石蠟切片各1例的PCR擴(kuò)增結(jié)果均陰性。 3.10例臨床疑似孢子絲菌病患者的組織標(biāo)本分別取自軀干(5例)，腕部(3例)，面部(1例)，眼瞼(1例)。新鮮組織真菌培養(yǎng)9例陽(yáng)性。菌落3-10天長(zhǎng)出。10例標(biāo)本提取基因組DNA，應(yīng)用引物S2-R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得結(jié)果9例陽(yáng)性，與真菌培養(yǎng)的復(fù)合率為100％。

8、 結(jié)論： 1．以感染孢子絲菌的小鼠模型為研究樣本篩選孢子絲菌特異引物，結(jié)果與在體外菌純培養(yǎng)菌株篩選所得結(jié)果相同，針對(duì)幾丁質(zhì)合成酶基因1的引物S2-R2為最特異、最敏感的引物。 2．與傳統(tǒng)方法相比，改良的微波脫蠟、液氮研磨-CTAB破壁法可以從存檔的石蠟包埋組織中提取足量、高質(zhì)量的孢子絲菌DNA。從而提高了PCR反應(yīng)的陽(yáng)性率。 3．應(yīng)用特異性S2-R2 引物檢測(cè)石蠟切片中的孢子絲菌陽(yáng)性率可高達(dá)91％。對(duì)培養(yǎng)陰性的