運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究BCR-ABL融合蛋白對(duì)DNA損傷修復(fù)蛋白質(zhì)的影響.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）的發(fā)生是由于t（9；22）（q34；q11）易位所致的bcr/abl融合基因，編碼產(chǎn)生了具有強(qiáng)烈酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白，該融合蛋白激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、導(dǎo)致一系列蛋白質(zhì)的表達(dá)異常，誘發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。盡管其具體分子機(jī)制仍然有待闡明，但越來(lái)越多的證據(jù)顯示細(xì)胞DNA損傷修復(fù)功能的失常在CML發(fā)生發(fā)展以及耐藥性表型中起重要作用。 有鑒于此，我們選

2、擇以DNA的損傷修復(fù)功能為切入點(diǎn)，運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)比分析BCR/ABLp210轉(zhuǎn)化細(xì)胞株與對(duì)照細(xì)胞株在經(jīng)DNA損傷后的細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)差異，為從整體角度探討B(tài)CR/ABL融合蛋白對(duì)DNA損傷修復(fù)功能的影響提供蛋白質(zhì)水平變化的信息。實(shí)驗(yàn)分三個(gè)部分進(jìn)行研究，主要方法、結(jié)果及結(jié)論如下： 1.穩(wěn)定表達(dá)BCR/ABL融合蛋白的小鼠BaF3-P210細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性的研究 將含有bcr/abl基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染到

3、包裝細(xì)胞，收集病毒感染小鼠BaF3細(xì)胞，經(jīng)篩選和亞克隆，獲得穩(wěn)定表達(dá)BCR/ABL融合蛋白的BaF3-P210轉(zhuǎn)化細(xì)胞；用PCR、DNA測(cè)序、RT-PCR和Westernblot檢測(cè)bcr/abl基因在BaF3-P210細(xì)胞中的整合和表達(dá)；用臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞儀（FCM）和MTT法研究BCR/ABL融合蛋白對(duì)BaF3細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：bcr/abl基因整合在BaF3細(xì)胞基因組中，BaF3-P210細(xì)胞能穩(wěn)

4、定表達(dá)bcr/abl基因及其蛋白。與對(duì)照組相比，BaF3-P210細(xì)胞增殖速度增快（P<0.05）；G0/G1期細(xì)胞比例下降，S期和G2/M期細(xì)胞比例增高（P<0.05）；經(jīng)ST1571處理后的細(xì)胞增殖抑制率為（54.08±1.90）％（P<0.05），早期凋亡率為（12.35±2.04）％（P<0.05）。 2.BaF3-P210細(xì)胞和對(duì)照BaF3-MIGR1細(xì)胞DNA損傷模型的建立及其修復(fù)的動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè) 選擇過(guò)氧化氫（H

5、2O2）為細(xì)胞DNA損傷的處理因素，采用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度H2O2誘導(dǎo)的BaF3-P210細(xì)胞和空載體感染細(xì)胞BaF3-MIGR1的DNA損傷以建立DNA損傷模型；繼而用彗星實(shí)驗(yàn)對(duì)兩組細(xì)胞在DNA損傷后的修復(fù)情況進(jìn)行不同時(shí)間段的動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BaF3-MIGR1細(xì)胞和BaF3-P210細(xì)胞DNA損傷模型的建立條件是：均采用50μmol/L終濃度的H2O2進(jìn)行染毒，H2O2作用溫度和時(shí)間為4℃，10 min。而B(niǎo)aF3-P210細(xì)

6、胞與BaF3-MIGR1細(xì)胞相比DNA損傷后修復(fù)時(shí)間縮短，在損傷后60 min即可達(dá)到完全修復(fù)，而后者在損傷后120 min才能完全修復(fù)（P<0.05）。 3.BaF3-P210細(xì)胞與對(duì)照BaF3-MIGR1細(xì)胞在經(jīng)H2P2誘導(dǎo)DNA損傷后的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析 采用雙向凝膠電泳技術(shù)對(duì)各樣品組全細(xì)胞蛋白進(jìn)行分離，通過(guò)優(yōu)化條件參數(shù)來(lái)確定合適的樣品上樣量和聚焦時(shí)間。用PDquest（7.0）軟件對(duì)掃描的二維凝膠電泳圖像進(jìn)行分析

7、，篩選出BaF3-P210細(xì)胞與BaF3-MIGR1空載體感染對(duì)照細(xì)胞在經(jīng)H2O2誘導(dǎo)DNA損傷后的差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)。候選差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)經(jīng)膠內(nèi)胰酶酶解，MALDI-TOF-MS分析，得到肽指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF），使用Mascot軟件在SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過(guò)優(yōu)化條件，最終確定合適的樣品上樣量為150

8、μg、最佳聚焦時(shí)間為70，000總伏特小時(shí)。通過(guò)對(duì)BaF3-P210細(xì)胞與BaF3-MIGR1細(xì)胞分別經(jīng)H2O2處理后細(xì)胞組的二維凝膠電泳圖像進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)約有41個(gè)蛋白斑點(diǎn)表達(dá)有差異，其中29個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，12個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。對(duì)其中35個(gè)差異蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析后，鑒定出了13種可能的差異表達(dá)蛋白。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)可以得出如下結(jié)論： 1.通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)成功構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)BCR/

9、ABL融合蛋白的小鼠BaF3-P210轉(zhuǎn)化細(xì)胞株；該細(xì)胞株具有增殖能力增強(qiáng)、細(xì)胞周期進(jìn)程加速和對(duì)STI571敏感的惡性表型特征。 2.進(jìn)一步通過(guò)彗星實(shí)驗(yàn)建立了BaF3-P210細(xì)胞和BaF3-MIGR1細(xì)胞的DNA損傷模型，并發(fā)現(xiàn)BCR/ABL融合蛋白可增強(qiáng)BaF3-P210細(xì)胞的DNA損傷后修復(fù)能力。 3.運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，兩組細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后，BaF3-P210細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了廣泛而復(fù)雜的蛋白表達(dá)的改變

10、。鑒定出的13個(gè)差異蛋白質(zhì)分別涉及到了DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白、細(xì)胞能量代謝相關(guān)蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白等。 綜上所述，本研究以小鼠BaF3-P210轉(zhuǎn)化細(xì)胞株為模型，選擇H2O2為細(xì)胞DNA損傷的處理因素，運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選到了若干受BCR/ABL融合蛋白影響的包括DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白在內(nèi)的差異蛋白，為進(jìn)一步闡明受BCR/ABL融合蛋白調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及探討B(tài)