非酒精性脂肪肝形成過程中肝臟蛋白質譜變化的研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是多種因素引起肝臟疾病的一種病理學改變。近年來引起高度重視的并不限于這一疾病的病理學表現(xiàn)，而是能量過剩。能量物質在肝內積聚，不僅是代謝綜合癥在肝內的特異表現(xiàn)，也是向非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatosis hepatitis，NASH)甚至肝硬化(liver cirrhosis)和肝癌發(fā)展的風險因素之一。隨著代謝綜

2、合癥(metabolic syndrome)的發(fā)病率逐年增高，非酒精性脂肪肝引起了人們的空前重視。除了社會進步，環(huán)境致病因素得以明確外，NAFLD發(fā)生的分子機制和發(fā)展規(guī)律仍不十分清楚。這給NAFLD的防治帶來了一定的困難。為此，本研究用高脂物質飼以大鼠，形成以能量過?！吣芪镔|在動物體內積聚→發(fā)展為代謝綜合癥和NAFLD模型。用二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis)與質譜(mass spect

3、rometry)聯(lián)合分析方法檢測NAFLD發(fā)展過程中不同階段的蛋白質譜變化，試圖找到一至兩種功能蛋白質分子，用以指導NAFLD發(fā)生機制的深入研究。
　　 方法：1.代謝綜合癥、NAFLD動物模型的建立：20只SD大鼠隨機分組后分別予以普通和高脂飼料喂養(yǎng)，觀察不同時間的體重、OGTT值、LEE指數(shù)、肝指數(shù)、體脂及血脂變化趨勢，并觀察不同時間肝臟的病理特征及電鏡下亞細胞水平損傷特點。2.肝臟蛋白質組學分析：在上述動物實驗基礎上，勻漿

4、抽提不同實驗階段大鼠肝臟總蛋白進行雙向凝膠電泳，從蛋白質表達豐度角度尋找差異表達蛋白質；對差異表達蛋白質進行胰酶酶解后用基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)做肽指紋圖，結合蛋白質數(shù)據(jù)庫搜索進行蛋白質鑒定，并分析各差異蛋白質在非酒精性脂肪肝形成過程中的作用。
　　 結果：1.高脂飼料喂養(yǎng)組的SD大鼠的體重較普通組明顯增高(P<0.05)；高脂組的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCH)及肝指數(shù)均較普通組增高，

5、差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；普通組大鼠糖耐量未見明顯異常，而高脂組則有明顯變化(P<0.05)。2.病理學改變：高脂組SD大鼠肝細胞脂肪變性程度及炎性活動度較普通組明顯(P<0.05)；電鏡掃描顯示高脂組大鼠肝細胞亞細胞水平出現(xiàn)肝細胞膜絨毛萎縮、膽微管擴張及線粒體腫脹等損害，而普通組大鼠類似病變則不明顯。3.在高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的不同階段中，肝內蛋白質組學的變化具有一定的規(guī)律性：a.肝內蛋白質點數(shù)越來越少，飼養(yǎng)至18周時肝內蛋白質點

6、數(shù)減少20％以上。b.不同時間的蛋白質變化以等電點不同的蛋白質變化最明顯，近中性的蛋白質點數(shù)顯現(xiàn)減少的趨勢，而偏酸性的蛋白質僅在18周時突然增多。c.有效地鑒定出4種酶蛋白質，分別為甲硫氨酸腺苷轉移酶1(methionine adenosyltransferase I.alpha)、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase，mu2)、還原型輔酶Ⅰ脫氫酶(NADH dehydrogenase)和醛脫氫酶Al(

7、aldehydedehydrogenase family9，subfamily Al)。其中前三種蛋白質表達量隨著高脂飲食的時間逐漸減少而醛脫氨酶則逐漸增多。
　　 結論：一、用高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠可模擬代謝綜合癥患者NAFLD的肝臟病理學改變。表現(xiàn)為：1.形態(tài)學：a.體重逐漸增加至肥胖，體內脂肪及肝脂含量增加；b.肝細胞內脂微粒形成；c.亞細胞水平損害的特點：呈現(xiàn)肝細胞膜絨毛萎縮→膽管細胞內出現(xiàn)微管→細胞線粒體腫脹的損害發(fā)生

8、順序。2.生化學：表現(xiàn)糖耐量異常，血甘油三酯(TG)和總膽固醇(TCH)升高。二、肝內蛋白質組學的變化具有一定的規(guī)律性，隨著喂以高脂飲食后出現(xiàn)如下變化：1.肝內蛋白質點數(shù)越來越少，飼養(yǎng)至18周時肝內蛋白質點數(shù)減少20％以上。2.不同時間的蛋白質變化以等電點不同的蛋白質變化最明顯，近中性的蛋白質點數(shù)顯現(xiàn)減少的趨勢，而偏酸性的蛋白質僅在18周時突然增多。3.有效地鑒定出4種酶蛋白質，分別為甲硫氨酸腺苷轉移酶1(methionine aden

9、osyltransferase I，alpha)、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase，mu2)、還原型輔酶Ⅰ脫氫酶(NADHdehydrogenase)和醛脫氫酶Al(aldehyde dehydrogenase family9，subfamily Al)。其中前三種蛋白質表達量隨著高脂飲食的時間逐漸減少而醛脫氨酶則逐漸增多。這一規(guī)律意味著隨著肝內脂肪的聚集，其抗氧化能力逐漸減弱，清除內源醛基化產(chǎn)物的