促紅細(xì)胞生成素對大鼠腦出血灶周組織Bcl-2、Bax的表達(dá)與神經(jīng)元凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 腦出血（ICH)是一種常見且致命的卒中類型，在生存者中常常遺留嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損，目前有效治療方法仍然有限。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一個(gè)調(diào)節(jié)血細(xì)胞生成的細(xì)胞因子，近來發(fā)現(xiàn)EPO及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，二者結(jié)合后具有促進(jìn)神經(jīng)生長、神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制較復(fù)雜，仍然不十分清楚。本研究采用自體血注射方法制備大鼠ICH模型，觀察ICH后神經(jīng)細(xì)胞凋亡與Bel-2、Bax表達(dá)的變化，并探討EPO的干預(yù)作用

2、及機(jī)制。 材料與方法: 1、動(dòng)物分組 110只Wistar雄性大鼠，體重220～270克，隨機(jī)分成四組：正常組、假手術(shù)組、ICH對照組、rhEPO治療組，后3組分為6h和12h、24h、48h、72h、120h、168h、7個(gè)亞組，每組5只。 2、ICH模型的制備 參照Xue和Yang的方法，大鼠稱重后給予10％水合氯醛腹腔注射麻醉(300mg/kg)，隨后俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，常規(guī)備皮

3、消毒，沿頭皮正中切開一長約10mm縱切口，切開骨膜，鈍性分離暴露前囟，調(diào)整立體定位儀，用微型手鉆在定位處鉆一直徑0.5mm的小孔，用微量注射儀取大鼠自體不凝血50ul，注入左側(cè)大鼠尾狀核部位，按20ul/min的速度緩慢勻速注入(3分鐘內(nèi)完成)。注血結(jié)束后留針5min，緩慢退針，縫合切口。假手術(shù)組除不注血外，其余步驟同上。術(shù)后5min治療組給予rhEPO按3000UI/Kg(用生理鹽水稀釋成0.5ml)腹腔注射。模型組及假手術(shù)組術(shù)后相應(yīng)

4、時(shí)間給予生理鹽水0.5ml腹腔注射。正常組大鼠不予手術(shù)及給藥。 3、腦標(biāo)本采集與組織學(xué)檢查 不同組別大鼠用10％水合氯醛(300mg／kg)腹腔注射麻醉后，剪開胸腔及右心耳，用一鈍針經(jīng)左心室插至主動(dòng)脈起始部，依次灌注4℃生理鹽水300ml，4％多聚甲醛400ml后，斷頭取腦。用4％多聚甲醛固定24～48h后，以針孔為中心，取厚為3mm的腦組織標(biāo)本。常規(guī)脫水、透明及浸蠟包埋，在切片機(jī)上連續(xù)切出片厚為5微米的切片，HE染色，

5、光鏡觀察組織學(xué)變化，數(shù)碼相機(jī)照相。 4、原位細(xì)胞凋亡檢測 標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟至水→新鮮配制3％H2O2室溫孵育10min→新鮮稀釋ProteinaseK37℃消化10min→加標(biāo)記液，37℃標(biāo)記2h→加封閉液室溫30min→加生物素化抗地高辛抗體37℃反應(yīng)30min→加SABC，37℃反應(yīng)30min→DAB顯色→蘇木素輕度復(fù)染→脫水、封片→顯微鏡下觀察。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。每張切片在出血側(cè)皮層計(jì)數(shù)

6、5個(gè)高倍鏡視野(×400)，取平均值，為該切片凋亡細(xì)胞數(shù)。 5、Bcl-2、Bax免疫組織化學(xué)檢測 標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟至水→3％H2O2室溫孵育15min→0.1％TBS中行微波抗原修復(fù)10min→正常山羊血清室溫孵育20min→滴加兔抗大鼠Bcl-2、Bax多克隆抗體(1:400)→4℃過夜→滴加生物素標(biāo)記二抗37℃孵育20min→滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素→37℃孵育20min→DAB顯色→水洗、復(fù)染、封片、光鏡

7、下觀察。Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞胞漿/胞膜被染成棕黃色，每張切片在出血側(cè)皮層計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野(×400)，取平均值為該切片Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞數(shù)。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用國際統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0處理數(shù)據(jù)，所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，多樣本比較用單因素方差分析；如果差異具有顯著性，則進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bax蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡，Bax/Bcl-2與細(xì)胞凋亡，采

8、用Pearson直線相關(guān)分析，P<0.05為顯著性差異。 結(jié)果: 1、HE染色 正常組皮層無壞死細(xì)胞，神經(jīng)元數(shù)量多，胞漿豐富，核質(zhì)細(xì)，核仁清楚；假手術(shù)組在針道處可見壞死細(xì)胞，數(shù)目極少。ICH對照組在術(shù)后皮層出血中心無神經(jīng)元，僅見少量膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞間質(zhì)空泡樣改變；出血邊緣區(qū)神經(jīng)元稀疏，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞縮小，胞膜與周圍分界清楚，并可見大量變性及壞死的神經(jīng)細(xì)胞，表現(xiàn)為胞體皺縮，核固縮深染，核仁消失。rhEPO治療組出

9、血中心區(qū)變小，邊緣區(qū)神經(jīng)細(xì)胞變性壞死減少，多數(shù)存活細(xì)胞形態(tài)相對正常，病變較輕。ICH對照組及rhEPO治療組術(shù)后6h血腫周圍皮質(zhì)可見大量變性及壞死的神經(jīng)細(xì)胞，并持續(xù)增多，72h達(dá)到高峰，120h變性及壞死的神經(jīng)細(xì)胞下降，各時(shí)間點(diǎn)rhEPO治療組與ICH對照組比較病變減輕。 2、腦出血及灶圍組織細(xì)胞凋亡情況 正常組大鼠大腦皮質(zhì)未見TUNEL陽性細(xì)胞，假手術(shù)組在針道處大腦皮質(zhì)有散在TUNEL陽性細(xì)胞。ICH對照組及rhEPO

10、治療組術(shù)后6h血腫周圍皮質(zhì)TUNEL陽性細(xì)胞已明顯增加，并持續(xù)增多，72h達(dá)到高峰，120h TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)下降，各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較差異有極顯著性。rhEPO治療組6h～168hTUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于同時(shí)點(diǎn)ICH對照組。 3、各組Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)的比較 正常組未見Bcl-2陽性細(xì)胞，假手術(shù)組在針道處大腦皮質(zhì)可見少量Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)。ICH對照組及rhEPO治療組術(shù)后6h血腫周圍皮質(zhì)Bcl-2陽

11、性細(xì)胞已明顯增加，并持續(xù)增多，72h達(dá)到高峰，120h Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)下降，各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較差異有極顯著性。rhEPO治療組術(shù)后6h～168h Bc1-2陽性細(xì)胞數(shù)較ICH對照組顯著增加。 4、各組Bax陽性細(xì)胞表達(dá)的比較 正常組未見Bax陽性細(xì)胞，假手術(shù)組在針道處大腦皮質(zhì)可見少量Bax陽性細(xì)胞表達(dá)。ICH對照組及rhEPO治療組術(shù)后6h血腫周圍皮質(zhì)Bax陽性細(xì)胞已明顯增加，并持續(xù)增多，72h達(dá)到高峰，120

12、h Bax陽性細(xì)胞數(shù)下降，各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較差異有極顯著性。rhEPO治療組術(shù)后6h～168h Bax陽性細(xì)胞數(shù)較ICH對照組顯著減少。 5、經(jīng)Pearson直線相關(guān)分析Bax蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)(r=0.889)，Bax/Bcl-2與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)(r=0.423)。 結(jié)論: 凋亡機(jī)制參與了腦出血后繼發(fā)性損傷的過程，促紅細(xì)胞生成素可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，對腦出血后神經(jīng)損傷