黏膜肥大細胞在食管黏膜屏障功能中作用的研究.pdf

1、一:背景和目的
　　胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)是胃十二指腸內容物反流入食管引起的以燒心?反酸為主要特征的臨床綜合征,食管上皮屏障功能受損是GERD患者的主要病理生理學特征之一,包括食管上皮間隙擴張(dilated intercellular spaces,DIS),上皮細胞緊密連接(tight junction, TJ)蛋白改變以及上皮通透性改變。應激是胃腸道屏障功能改

2、變的一重要因素,近年來許多研究顯示應激下腸道屏障功能障礙依賴于肥大細胞(mast cell, MC)。我們前期的研究顯示應激下食管屏障功能受損且伴有MC增多,故本研究旨在利用MC缺陷大鼠(Ws/Ws大鼠)與正常野生大鼠(+/+大鼠)對比試驗,探討MC在應激導致的食管屏障功能障礙中的作用。
　　材料和方法
　　1.慢性束縛應激模型的建立
　　+/+大鼠由北京維通利華公司購入,Ws/Ws大鼠由由日本TGC Inc.公司購入

3、,束縛應激均在每天上午9:30~11:30進行,連續(xù)7天,第八日犧牲大鼠,取材。
　　2.+/+大鼠及Ws/Ws大鼠應激狀態(tài)的確定
　　記錄所有大鼠應激7日內體重變化,放射免疫法測量應激期間內和應激結束后血中下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)相關應激激素的含量。
　　3.+/+大鼠及Ws/Ws大鼠應激后食管黏膜炎癥狀況評估
　　食管組織常規(guī)包埋、切片和H&E染色,請有經驗的病理科醫(yī)師對食管黏膜炎癥進行評分;食管黏

4、膜CD3+淋巴細胞免疫組化(immunohistochemistry, IHC)染色,進行食管黏膜炎癥細胞浸潤的評估;中性粒細胞髓過氧化物酶(MPO)活性的免疫印跡(western blot,WB)分析。
　　4.+/+大鼠及Ws/Ws大鼠應激后食管上皮屏障功能變化的評估
　　食管上皮細胞間隙(intercellular spaces, ICS)在電鏡下(2500×)拍攝圖片,用IPP6.0軟件測量棘層細胞間隙;食管上皮TJ

5、蛋白(claudin1,claudin3,occludin及ZO-1)含量由WB檢測。
　　5.+/+大鼠及Ws/Ws大鼠應激后MC功能的評估
　　食管黏膜及黏膜下層MC增生的狀況通過阿爾新藍-番紅O染色進行計數(shù);MC活化的評估由電鏡下觀察其顆粒形態(tài)的變化,計算活化比例;MC釋放的類胰蛋白酶(tryptase)由免疫熒光(immunofluorescence,IF)染色觀察其分布,并用WB進行蛋白定量分析。
　　6.探

6、討MC與食管黏膜CRF-R分布的關系
　　用IF共染色觀察促腎上腺皮質激素釋放因子受體(corticotropin-releasing factor receptor,CRF-R)的兩種類型(CRF-R1,CRF-R2)在食管的分布,同時用tryptase抗體標記MC,以觀察兩者的共表達;用 WB對應激前后CRF-R在食管的表達進行定量。
　　7.探討MC釋放的tryptase與食管上皮PAR2的作用食管上皮PAR2和IL-

7、8的表達由WB進行定量。
　　結果
　　1.+/+大鼠及Ws/Ws大鼠均受到應激的影響且伴有應激后HPA軸激活
　　在慢性束縛應激7天中,+/+大鼠及Ws/Ws大鼠體重均逐漸下降,說明+/+大鼠及Ws/Ws大鼠均受到應激的影響,機體一般狀況下降。在應激7天中,血促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone, CRH)和皮質酮(corticosterone, CORT)較對照均

8、升高;在應激結束后(第八天),+/+大鼠及Ws/Ws大鼠的血清CORT水平與對照差異已不顯著,而血漿CRH仍高于對照。說明CORT在應激的急性過程中增加,應激結束后回落至正常;而CRH在慢性應激結束后仍較高,反應了HPA軸在應激結束后可能存在短暫的持續(xù)活化狀態(tài)。MC對于應激的感知無影響。
　　2.+/+大鼠及Ws/Ws大鼠應激后食管黏膜炎癥狀況較非應激組均無顯著差別
　　各組大鼠黏膜炎癥評分狀況無明顯差別;CD3+淋巴細胞數(shù)

9、和中性粒細胞 MPO活性在各組大鼠中亦無顯著差別。
　　3.+/+大鼠存在應激后食管上皮屏障功能的變化,而Ws/Ws大鼠缺乏此改變
　　+/+大鼠在應激后 ICS增寬,與對照組相比有統(tǒng)計學意義(0.74±0.17μm vs.0.56±0.13μm, p<0.001, n=16);應激 Ws/Ws大鼠與對照相比,ICS無顯著增寬(0.62±0.11μm vs.0.56±0.13μm, p=0.592, n=16)。+/+大鼠在

10、應激后食管上皮TJ蛋白occludin和ZO-1表達顯著降低(0.42±0.2vs.0.95±0.1, p=0.03, n=6;0.31±0.16vs.0.93±0.32, p=0.04, n=6),但Ws/Ws大鼠應激后TJ蛋白無顯著變化。
　　4.+/+大鼠應激后食管MC增生且活化,Ws/Ws大鼠食管未見MC
　　+/+大鼠應激后MC較對照顯著增多(4.54±1.56 vs.2.85±0.94, p<0.05, n=16

11、),電鏡下活化比例較對照顯著增加(38.3％vs.16.7%, p<0.05),食管黏膜tryptase含量顯著增加1倍(n=6,p<0.05)。
　　5.食管MC少見CRF-R表達,但與CRF-R陽性神經元/纖維毗鄰
　　CRF-R1及 CRF-R2均在食管黏膜下神經叢有表達,MC常分布在與其毗鄰區(qū)域,少數(shù) MC表面可表達 CRF-R。應激后+/+大鼠 CRF-R表達顯著上調(p<0.05),而Ws/Ws大鼠應激后無此變化

12、;+/+大鼠和 Ws/Ws大鼠的CRF-R基礎表達量無明顯差別。
　　6.應激下MC釋放的tryptase可能與PAR2作用從而調節(jié)食管屏障
　　+/+大鼠應激后食管PAR2和IL-8表達增加約1倍(p<0.05),與tryptase增加趨勢一致,Ws/Ws大鼠無類似變化,說明此變化具有MC依賴性。
　　結論
　　1.慢性束縛應激可導致大鼠以CRH水平升高為標志的HPA軸持續(xù)活化,肥大細胞對大鼠慢性應激后HPA軸

13、激活無明顯影響。
　　2.慢性應激可致大鼠食管黏膜輕度炎癥和食管黏膜屏障功能的改變;應激所致的黏膜屏障功能改變表現(xiàn)為上皮細胞間隙增寬和緊密連接蛋白(occludin,ZO1)改變,具有MC依賴性。
　　3.慢性應激可致大鼠食管黏膜MC增生活化,tryptase釋放增加,激活食管上皮PAR2,并伴有IL-8釋放增加,最終介導屏障功能的改變。
　　摘要二:背景和目的
　　MC來源于造血干細胞,但直至其前體細胞從血液中

14、游走到組織才發(fā)育為成熟MC。MC的的前體細胞及成熟MC均表達酪氨酸激酶受體蛋白( KIT蛋白),前體細胞在KIT蛋白的配體干細胞生長因子(stem cell factor,SCF)的作用下,發(fā)育為成熟的MC,故KIT→SCF信號通路為MC發(fā)育的關鍵。對于MC在體功能的研究最好的手段是用MC缺陷動物,各種MC缺陷動物均是由于KIT→SCF信號通路受損而導致無成熟的MC發(fā)育。我們前期研究采用的MC缺陷大鼠(W s/W s大鼠)即為編碼KIT

15、蛋白的W等位基因發(fā)生Ws突變后,最終導致MC不能發(fā)育。但此種缺陷由于是前體細胞的基因缺陷,可通過骨髓移植(bone marrow transplantation, BMT)重建其缺失的前體細胞,從而使MC缺陷動物發(fā)育出正常的MC。許多研究在MC缺失的小鼠上進行骨髓移植重建MC,但Ws/Ws大鼠骨髓移植重建MC的研究相對較少。我們欲在前期Ws/Ws大鼠工作的基礎上進一步構建BMT-Ws/Ws大鼠,并熟悉新生MC的生長發(fā)育特性,有助于我們更

16、好的利用BMT-Ws/Ws大鼠進行后續(xù)MC在體功能的研究。
　　材料和方法
　　1.實驗動物繁育
　　Ws/Ws大鼠由日本TGC Inc.公司購入的6周齡種鼠,飼養(yǎng)于北京大學醫(yī)學部SPF級動物實驗室,與維通利華公司購入的與其同基因背景的Brown Norway(BN)的種鼠雜交繁育后代。
　　2.確定Ws/Ws大鼠Co60照射的合適劑量
　　將8周Ws/Ws大鼠分成6種照射劑量組(6Gy,7Gy,8Gy,9

17、Gy,10Gy,11Gy)。照射后密切觀察Ws/Ws大鼠有無放射損傷表現(xiàn)并每天記錄體重。觀察終點均為大鼠死亡,記錄每只Ws/Ws大鼠的死亡天數(shù)。根據不同劑量組大鼠照射后的衰竭程度以及死亡終點時間可判斷不同照射劑量對Ws/Ws大鼠的損傷大小。
　　3.骨髓移植及外源骨髓存活鑒定
　　Ws/Ws大鼠在照射后4h內尾靜脈輸注+/+大鼠的骨髓細胞懸液0.5ml,約含5×107個骨髓細胞。我們采用雄性+/+大鼠骨髓移植入雌性Ws/Ws

18、大鼠,同時設立陰性對照,常規(guī)飼養(yǎng)4周后通過y染色體原位雜交技術(y-chromosome Fluorescence In Situ Hybridization,y-FISH)進行外源雄性+/+大鼠骨髓的存活鑒定。
　　4.移植后肥大細胞在消化道重建觀察
　　批量構建BMT-Ws/Ws雄鼠。分別在移植后5w、8w、13w、23w的時間點觀察其內臟貧血改善情況,取食管、胃、小腸、大腸組織,做消化道肥大細胞阿爾新藍-番紅O染色并計

19、數(shù),肥大細胞蛋白酶(trypatse和chymase)由western blot定量。
　　結果
　　1.確定Ws/Ws大鼠接受BMT前的適宜毀髓照射劑量為7.5Gy
　　照射后若不給于其骨髓移植,所有大鼠的終點均為造血衰竭性死亡;照射劑量不同,其體重衰減的幅度和放射性損傷出現(xiàn)的時間和程度均有差別。8Gy和7Gy的表
　　現(xiàn)似為衰竭與耐受的分界劑量,可認為分別為最小致死量和最大耐受量,故最終將適宜毀髓照射劑量定為

20、7.5Gy。
　　2.經y-FISH鑒定,外源骨髓可在Ws/Ws大鼠體內存活并分化遷移至外周
　　在對照雌性Ws/Ws大鼠只可見含12號常染色體(內對照)熒光信號的FISH陽性細胞,說明完全無y染色體的存在;在接受雄性+/+大鼠骨髓移植的雌性Ws/Ws大鼠中,可見表達y染色體熒光信號的FISH陽性細胞,且這些細胞主要分布小腸黏膜固有層,說明這些細胞由供體骨髓細胞分化發(fā)育遷移至消化道。
　　3. BMT-Ws/Ws大鼠消

21、化道各部位MC生長發(fā)育-數(shù)目和蛋白酶含量的變化
　　BMT后5w消化道尚無MC發(fā)育,8w外源骨髓增值分化能力最強,此時MC數(shù)目最多,之后逐漸回落,提示外源骨髓增值分化能力隨著時間的推移在逐漸減弱。BMT后蛋白酶的變化趨勢與MC數(shù)目相關,消化道組織中tryptase是MC比較衡定的內容物成分,其含量很大程度決定于于MC的數(shù)量;而chymase含量依消化道各部位MC亞型的不同,其含量略有變異,因此不完全取決于MC的數(shù)目。
　　結

22、論
　　1.8周齡Ws/Ws大鼠在接受7.5Gy的Co60照射后,注射約5×107個細胞的正常+/+大鼠的骨髓懸液,可重建缺陷骨髓功能。
　　2.y-FISH鑒定外源骨髓移植后可以存活,并分化發(fā)育遷移至消化道。
　　3.消化道MC可被BMT重建,移植后8周至13周為外源骨髓增殖分化能力最強之時,伴有數(shù)目最多的MC發(fā)育及豐富的tryptase,此階段可作為BMT-Ws/Ws大鼠用于MC功能實驗研究的最佳時間窗。
　

23、　摘要三:背景和目的
　　24小時食管阻抗-pH聯(lián)合監(jiān)測(multichannel intraluminal impedance and pH monitoring, MII-pH)目前主要用于監(jiān)測GERD患者胃食管反流的狀況。然而當無反流或吞咽事件時,阻抗值處于基線狀態(tài),此時食管壁與MII-pH導管電極相接觸,阻抗基線值則反應的是食管壁本身的導電性能,與食管壁組織的生理狀態(tài)相關。近兩年有研究表明對健康人以及兔子食管進行酸灌注,可