黏膜肥大細(xì)胞在食管黏膜屏障功能中作用的研究.pdf

1、一:背景和目的
　　胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)是胃十二指腸內(nèi)容物反流入食管引起的以燒心?反酸為主要特征的臨床綜合征,食管上皮屏障功能受損是GERD患者的主要病理生理學(xué)特征之一,包括食管上皮間隙擴(kuò)張(dilated intercellular spaces,DIS),上皮細(xì)胞緊密連接(tight junction, TJ)蛋白改變以及上皮通透性改變。應(yīng)激是胃腸道屏障功能改

2、變的一重要因素,近年來許多研究顯示應(yīng)激下腸道屏障功能障礙依賴于肥大細(xì)胞(mast cell, MC)。我們前期的研究顯示應(yīng)激下食管屏障功能受損且伴有MC增多,故本研究旨在利用MC缺陷大鼠(Ws/Ws大鼠)與正常野生大鼠(+/+大鼠)對比試驗,探討MC在應(yīng)激導(dǎo)致的食管屏障功能障礙中的作用。
　　材料和方法
　　1.慢性束縛應(yīng)激模型的建立
　　+/+大鼠由北京維通利華公司購入,Ws/Ws大鼠由由日本TGC Inc.公司購入

3、,束縛應(yīng)激均在每天上午9:30~11:30進(jìn)行,連續(xù)7天,第八日犧牲大鼠,取材。
　　2.+/+大鼠及Ws/Ws大鼠應(yīng)激狀態(tài)的確定
　　記錄所有大鼠應(yīng)激7日內(nèi)體重變化,放射免疫法測量應(yīng)激期間內(nèi)和應(yīng)激結(jié)束后血中下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)相關(guān)應(yīng)激激素的含量。
　　3.+/+大鼠及Ws/Ws大鼠應(yīng)激后食管黏膜炎癥狀況評估
　　食管組織常規(guī)包埋、切片和H&E染色,請有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師對食管黏膜炎癥進(jìn)行評分;食管黏

4、膜CD3+淋巴細(xì)胞免疫組化(immunohistochemistry, IHC)染色,進(jìn)行食管黏膜炎癥細(xì)胞浸潤的評估;中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶(MPO)活性的免疫印跡(western blot,WB)分析。
　　4.+/+大鼠及Ws/Ws大鼠應(yīng)激后食管上皮屏障功能變化的評估
　　食管上皮細(xì)胞間隙(intercellular spaces, ICS)在電鏡下(2500×)拍攝圖片,用IPP6.0軟件測量棘層細(xì)胞間隙;食管上皮TJ

5、蛋白(claudin1,claudin3,occludin及ZO-1)含量由WB檢測。
　　5.+/+大鼠及Ws/Ws大鼠應(yīng)激后MC功能的評估
　　食管黏膜及黏膜下層MC增生的狀況通過阿爾新藍(lán)-番紅O染色進(jìn)行計數(shù);MC活化的評估由電鏡下觀察其顆粒形態(tài)的變化,計算活化比例;MC釋放的類胰蛋白酶(tryptase)由免疫熒光(immunofluorescence,IF)染色觀察其分布,并用WB進(jìn)行蛋白定量分析。
　　6.探

6、討MC與食管黏膜CRF-R分布的關(guān)系
　　用IF共染色觀察促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體(corticotropin-releasing factor receptor,CRF-R)的兩種類型(CRF-R1,CRF-R2)在食管的分布,同時用tryptase抗體標(biāo)記MC,以觀察兩者的共表達(dá);用 WB對應(yīng)激前后CRF-R在食管的表達(dá)進(jìn)行定量。
　　7.探討MC釋放的tryptase與食管上皮PAR2的作用食管上皮PAR2和IL-

7、8的表達(dá)由WB進(jìn)行定量。
　　結(jié)果
　　1.+/+大鼠及Ws/Ws大鼠均受到應(yīng)激的影響且伴有應(yīng)激后HPA軸激活
　　在慢性束縛應(yīng)激7天中,+/+大鼠及Ws/Ws大鼠體重均逐漸下降,說明+/+大鼠及Ws/Ws大鼠均受到應(yīng)激的影響,機(jī)體一般狀況下降。在應(yīng)激7天中,血促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone, CRH)和皮質(zhì)酮(corticosterone, CORT)較對照均

8、升高;在應(yīng)激結(jié)束后(第八天),+/+大鼠及Ws/Ws大鼠的血清CORT水平與對照差異已不顯著,而血漿CRH仍高于對照。說明CORT在應(yīng)激的急性過程中增加,應(yīng)激結(jié)束后回落至正常;而CRH在慢性應(yīng)激結(jié)束后仍較高,反應(yīng)了HPA軸在應(yīng)激結(jié)束后可能存在短暫的持續(xù)活化狀態(tài)。MC對于應(yīng)激的感知無影響。
　　2.+/+大鼠及Ws/Ws大鼠應(yīng)激后食管黏膜炎癥狀況較非應(yīng)激組均無顯著差別
　　各組大鼠黏膜炎癥評分狀況無明顯差別;CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)

9、和中性粒細(xì)胞 MPO活性在各組大鼠中亦無顯著差別。
　　3.+/+大鼠存在應(yīng)激后食管上皮屏障功能的變化,而Ws/Ws大鼠缺乏此改變
　　+/+大鼠在應(yīng)激后 ICS增寬,與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(0.74±0.17μm vs.0.56±0.13μm, p<0.001, n=16);應(yīng)激 Ws/Ws大鼠與對照相比,ICS無顯著增寬(0.62±0.11μm vs.0.56±0.13μm, p=0.592, n=16)。+/+大鼠在

10、應(yīng)激后食管上皮TJ蛋白o(hù)ccludin和ZO-1表達(dá)顯著降低(0.42±0.2vs.0.95±0.1, p=0.03, n=6;0.31±0.16vs.0.93±0.32, p=0.04, n=6),但Ws/Ws大鼠應(yīng)激后TJ蛋白無顯著變化。
　　4.+/+大鼠應(yīng)激后食管MC增生且活化,Ws/Ws大鼠食管未見MC
　　+/+大鼠應(yīng)激后MC較對照顯著增多(4.54±1.56 vs.2.85±0.94, p<0.05, n=16

11、),電鏡下活化比例較對照顯著增加(38.3％vs.16.7%, p<0.05),食管黏膜tryptase含量顯著增加1倍(n=6,p<0.05)。
　　5.食管MC少見CRF-R表達(dá),但與CRF-R陽性神經(jīng)元/纖維毗鄰
　　CRF-R1及 CRF-R2均在食管黏膜下神經(jīng)叢有表達(dá),MC常分布在與其毗鄰區(qū)域,少數(shù) MC表面可表達(dá) CRF-R。應(yīng)激后+/+大鼠 CRF-R表達(dá)顯著上調(diào)(p<0.05),而Ws/Ws大鼠應(yīng)激后無此變化

12、;+/+大鼠和 Ws/Ws大鼠的CRF-R基礎(chǔ)表達(dá)量無明顯差別。
　　6.應(yīng)激下MC釋放的tryptase可能與PAR2作用從而調(diào)節(jié)食管屏障
　　+/+大鼠應(yīng)激后食管PAR2和IL-8表達(dá)增加約1倍(p<0.05),與tryptase增加趨勢一致,Ws/Ws大鼠無類似變化,說明此變化具有MC依賴性。
　　結(jié)論
　　1.慢性束縛應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠以CRH水平升高為標(biāo)志的HPA軸持續(xù)活化,肥大細(xì)胞對大鼠慢性應(yīng)激后HPA軸

13、激活無明顯影響。
　　2.慢性應(yīng)激可致大鼠食管黏膜輕度炎癥和食管黏膜屏障功能的改變;應(yīng)激所致的黏膜屏障功能改變表現(xiàn)為上皮細(xì)胞間隙增寬和緊密連接蛋白(occludin,ZO1)改變,具有MC依賴性。
　　3.慢性應(yīng)激可致大鼠食管黏膜MC增生活化,tryptase釋放增加,激活食管上皮PAR2,并伴有IL-8釋放增加,最終介導(dǎo)屏障功能的改變。
　　摘要二:背景和目的
　　MC來源于造血干細(xì)胞,但直至其前體細(xì)胞從血液中

14、游走到組織才發(fā)育為成熟MC。MC的的前體細(xì)胞及成熟MC均表達(dá)酪氨酸激酶受體蛋白( KIT蛋白),前體細(xì)胞在KIT蛋白的配體干細(xì)胞生長因子(stem cell factor,SCF)的作用下,發(fā)育為成熟的MC,故KIT→SCF信號通路為MC發(fā)育的關(guān)鍵。對于MC在體功能的研究最好的手段是用MC缺陷動物,各種MC缺陷動物均是由于KIT→SCF信號通路受損而導(dǎo)致無成熟的MC發(fā)育。我們前期研究采用的MC缺陷大鼠(W s/W s大鼠)即為編碼KIT

15、蛋白的W等位基因發(fā)生Ws突變后,最終導(dǎo)致MC不能發(fā)育。但此種缺陷由于是前體細(xì)胞的基因缺陷,可通過骨髓移植(bone marrow transplantation, BMT)重建其缺失的前體細(xì)胞,從而使MC缺陷動物發(fā)育出正常的MC。許多研究在MC缺失的小鼠上進(jìn)行骨髓移植重建MC,但Ws/Ws大鼠骨髓移植重建MC的研究相對較少。我們欲在前期Ws/Ws大鼠工作的基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建BMT-Ws/Ws大鼠,并熟悉新生MC的生長發(fā)育特性,有助于我們更

16、好的利用BMT-Ws/Ws大鼠進(jìn)行后續(xù)MC在體功能的研究。
　　材料和方法
　　1.實驗動物繁育
　　Ws/Ws大鼠由日本TGC Inc.公司購入的6周齡種鼠,飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級動物實驗室,與維通利華公司購入的與其同基因背景的Brown Norway(BN)的種鼠雜交繁育后代。
　　2.確定Ws/Ws大鼠Co60照射的合適劑量
　　將8周Ws/Ws大鼠分成6種照射劑量組(6Gy,7Gy,8Gy,9

17、Gy,10Gy,11Gy)。照射后密切觀察Ws/Ws大鼠有無放射損傷表現(xiàn)并每天記錄體重。觀察終點(diǎn)均為大鼠死亡,記錄每只Ws/Ws大鼠的死亡天數(shù)。根據(jù)不同劑量組大鼠照射后的衰竭程度以及死亡終點(diǎn)時間可判斷不同照射劑量對Ws/Ws大鼠的損傷大小。
　　3.骨髓移植及外源骨髓存活鑒定
　　Ws/Ws大鼠在照射后4h內(nèi)尾靜脈輸注+/+大鼠的骨髓細(xì)胞懸液0.5ml,約含5×107個骨髓細(xì)胞。我們采用雄性+/+大鼠骨髓移植入雌性Ws/Ws

18、大鼠,同時設(shè)立陰性對照,常規(guī)飼養(yǎng)4周后通過y染色體原位雜交技術(shù)(y-chromosome Fluorescence In Situ Hybridization,y-FISH)進(jìn)行外源雄性+/+大鼠骨髓的存活鑒定。
　　4.移植后肥大細(xì)胞在消化道重建觀察
　　批量構(gòu)建BMT-Ws/Ws雄鼠。分別在移植后5w、8w、13w、23w的時間點(diǎn)觀察其內(nèi)臟貧血改善情況,取食管、胃、小腸、大腸組織,做消化道肥大細(xì)胞阿爾新藍(lán)-番紅O染色并計

19、數(shù),肥大細(xì)胞蛋白酶(trypatse和chymase)由western blot定量。
　　結(jié)果
　　1.確定Ws/Ws大鼠接受BMT前的適宜毀髓照射劑量為7.5Gy
　　照射后若不給于其骨髓移植,所有大鼠的終點(diǎn)均為造血衰竭性死亡;照射劑量不同,其體重衰減的幅度和放射性損傷出現(xiàn)的時間和程度均有差別。8Gy和7Gy的表
　　現(xiàn)似為衰竭與耐受的分界劑量,可認(rèn)為分別為最小致死量和最大耐受量,故最終將適宜毀髓照射劑量定為

20、7.5Gy。
　　2.經(jīng)y-FISH鑒定,外源骨髓可在Ws/Ws大鼠體內(nèi)存活并分化遷移至外周
　　在對照雌性Ws/Ws大鼠只可見含12號常染色體(內(nèi)對照)熒光信號的FISH陽性細(xì)胞,說明完全無y染色體的存在;在接受雄性+/+大鼠骨髓移植的雌性Ws/Ws大鼠中,可見表達(dá)y染色體熒光信號的FISH陽性細(xì)胞,且這些細(xì)胞主要分布小腸黏膜固有層,說明這些細(xì)胞由供體骨髓細(xì)胞分化發(fā)育遷移至消化道。
　　3. BMT-Ws/Ws大鼠消

21、化道各部位MC生長發(fā)育-數(shù)目和蛋白酶含量的變化
　　BMT后5w消化道尚無MC發(fā)育,8w外源骨髓增值分化能力最強(qiáng),此時MC數(shù)目最多,之后逐漸回落,提示外源骨髓增值分化能力隨著時間的推移在逐漸減弱。BMT后蛋白酶的變化趨勢與MC數(shù)目相關(guān),消化道組織中tryptase是MC比較衡定的內(nèi)容物成分,其含量很大程度決定于于MC的數(shù)量;而chymase含量依消化道各部位MC亞型的不同,其含量略有變異,因此不完全取決于MC的數(shù)目。
　　結(jié)

22、論
　　1.8周齡Ws/Ws大鼠在接受7.5Gy的Co60照射后,注射約5×107個細(xì)胞的正常+/+大鼠的骨髓懸液,可重建缺陷骨髓功能。
　　2.y-FISH鑒定外源骨髓移植后可以存活,并分化發(fā)育遷移至消化道。
　　3.消化道MC可被BMT重建,移植后8周至13周為外源骨髓增殖分化能力最強(qiáng)之時,伴有數(shù)目最多的MC發(fā)育及豐富的tryptase,此階段可作為BMT-Ws/Ws大鼠用于MC功能實驗研究的最佳時間窗。
　

23、　摘要三:背景和目的
　　24小時食管阻抗-pH聯(lián)合監(jiān)測(multichannel intraluminal impedance and pH monitoring, MII-pH)目前主要用于監(jiān)測GERD患者胃食管反流的狀況。然而當(dāng)無反流或吞咽事件時,阻抗值處于基線狀態(tài),此時食管壁與MII-pH導(dǎo)管電極相接觸,阻抗基線值則反應(yīng)的是食管壁本身的導(dǎo)電性能,與食管壁組織的生理狀態(tài)相關(guān)。近兩年有研究表明對健康人以及兔子食管進(jìn)行酸灌注,可