Brugada綜合征患者心臟鈉通道蛋白α亞基編碼基因檢測及致病機理探討.pdf

1、研究背景:
　　 Brugada綜合征(Brugada Syndrome)自1992年被西班牙學者Brugada兩兄弟報道以來，世界各地學者對其的認識程度也不斷加深，它是一種以右胸導聯(lián)ST段抬高為特征，并且經(jīng)常伴有心臟不同水平的傳導延緩，具有發(fā)生致命性室性心律失常的潛在風險或者家族史中有猝死病史等為特點的遺傳性心律失常疾病。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)最小的患者為幾個月大的嬰兒，而最大的患者高達84歲，但大多數(shù)典型的Brugada綜合征首次

2、發(fā)病多發(fā)生于患者的30-40歲期間，而男性發(fā)病率明顯高于女性，是導致青年男子猝死的重要病因。據(jù)估計，Brugada綜合征占全部猝死病因的4-12％，而在沒有器質(zhì)性心臟病的猝死病例中，Brugada綜合征患者比例高達20％。據(jù)文獻報道，Brugada綜合征全球發(fā)病率大約為5/10000，有明確臨床表現(xiàn)的Brugada綜合征在西方國家的發(fā)病率為1/5000-10000，東南亞及日本地區(qū)發(fā)病率為0.12-0.14％。值得一提的是，在東南亞地區(qū)

3、，Brugada綜合征導致的青年人猝死率僅次于交通事故致死率，而成為該地區(qū)年輕男子的第二大“殺手”。
　　 近年來，借助當今日新月異迅猛發(fā)展的分子生物學、分子遺傳學等領域的新技術，世界各地學者針對發(fā)生于“健康”人群的猝死患者展開了深入細致的研究，Brugada綜合征的神秘面紗已經(jīng)被學者們逐漸揭開。研究發(fā)現(xiàn)，Brugada綜合征和先天性QT間期延長綜合征(LQTS)一樣，是一種編碼心臟離子通道蛋白的基因發(fā)生異常從而導致的遺傳性心律

4、失常疾病，其遺傳方式為常染色體顯性遺傳，但表現(xiàn)型受到多種因素（發(fā)熱，飲酒，基因多態(tài)性等）影響而導致其具有不完全外顯的特征。自1998年美國學者Chen等發(fā)現(xiàn)了第一個導致BrS發(fā)病的相關基因——編碼心臟鈉離子通道蛋白α亞基的基因(SCN5A)開始，到目前為止，在Brugada綜合征患者的SCN5A基因上共發(fā)現(xiàn)100余個可能與之發(fā)病有關系的點突變，學者們對部分突變已經(jīng)展開了功能表達研究，確定了它們的致病作用。
　　 SCN5A基因位

5、于人類三號染色體上，負責編碼心臟電壓門控性鈉通道蛋白α亞基，該亞基共2016個氨基酸，在細胞膜上形成4個類似的同源結(jié)構(gòu)域(DI-DIV)，每個區(qū)域由6個跨膜片段(S1-S6)組成，各區(qū)連接段在胞內(nèi)形成一個叫P-Loop的結(jié)構(gòu)，4個區(qū)的P-Loop結(jié)構(gòu)形成一個供鈉通道流入的孔。研究表明，該基因缺陷影響鈉離子通道蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，導致瞬時外向鉀離子電流(Ito)絕對或相對增強，使得心室肌外層復極1期末切跡加深，心肌細胞進入動作電位平臺期后，

6、心內(nèi)外層復極時同一時間跨壁電壓差持續(xù)存在導致體表心電圖的ST段持續(xù)抬高。而Ito離子流強弱程度導致Brugada波呈現(xiàn)不同形態(tài)，在Ito離子流較弱時， T波直立，心電圖ST段呈現(xiàn)“馬鞍形”抬高;反之則出現(xiàn)帳篷樣改變伴T波倒置。而同時1期復極末切跡過深使得動作電位2期不但內(nèi)外層心肌存在跨壁電壓差，并且在外層各部分之間存在復極離散，造成2相折返，引發(fā)室性心律失常。
　　 近些年來，基于對Brugada綜合征發(fā)病機制研究的越來越清晰化

7、，在各國學者共同努力之下，在針對Brugada綜合征的分子遺傳學研究方面取得了突飛猛進的成果，不斷發(fā)現(xiàn)其他幾個相關基因，如GPD1-L、SCN1b、SCN3b、CACNA1C、CACNBβ2b、KCNE3和KCNH2。2011HRS/EHRA新公布的針對遺傳性離子通道病的基因檢測的專家共識明確指出:目前發(fā)現(xiàn)Brugada綜合征的致病基因至少牽涉8個基因。SCN5A基因占了基因型陽性的Brugada綜合征病例的絕大部分(＞75％)。然而，

8、在對那些具有明確臨床表現(xiàn)的Brugada綜合征患者進行基因檢測時，SCN5A基因異常的檢出率僅為25％。尚有大部分(＞65％)的Brugada綜合征患者不能確定其致病基因。這表明，尚有其他基因可能導致出現(xiàn)Brugada綜合征，由此看來，目前我們對Brugada綜合征致病基因的認識還十分膚淺，僅僅是冰山一角，所以Brugada綜合征致病基因研究任重而道遠。正因如此，該共識也推薦對確診為Brugada綜合征的患者及其家屬進行以SCN5A基因

9、為主兼顧其他基因的全面基因，一方面明確患者的致病位點，另一方面有利于發(fā)現(xiàn)尚未報道的新基因位點，為此，美國心、肺、血研究所(NHLBI)和少見病辦公室(ORD)于2006年9月也聯(lián)合召開了專題研討會議，建議加強遺傳性離子通道病的研究，推動科研以期改進遺傳性心律失常疾病的診斷和治療。目前，遺傳性心律失常的遺傳學研究已經(jīng)成為當今心律失常學領域的研究熱點，它不但能揭示心律失常背后的本質(zhì)，而且能為臨床決策提供強有力的指導證據(jù)。
　　 目的

10、:
　　 我們以因不明原因暈厥來南方醫(yī)院心內(nèi)科就診并依據(jù)國際通用準則確診為Brugada綜合征的3名患者作為研究對象，建立臨床資料，抽取其外周全血樣本，提取白細胞中全基因組DNA，以SCN5A基因為候選基因，取用DNA提取產(chǎn)物對其28個外顯子部分進行PCR擴增，將產(chǎn)物直接測序分析，明確患者是否攜帶SCN5A基因變異位點，有助于發(fā)現(xiàn)致中國人群發(fā)生Brugada綜合征新的基因變異位點，進一步明確其致病原因，并結(jié)合相關文獻探討其致病機

11、理，豐富我們對中國人群中Brugada綜合征發(fā)病的分子遺傳學的認識。
　　 研究對象:
　　 全部研究對象均來自2009年1月-2011年1月在南方醫(yī)院心內(nèi)科就診并確診為Brugada綜合征的住院患者，3名患者均為男性，年齡32-70歲，3例患者均接受血生化、心肌酶譜、肌鈣蛋白、胸片、腦電圖、頭顱CT及超聲心動圖等檢查，45歲以上患者加行冠脈造影檢查，所有患者均有暈厥病史但并未發(fā)現(xiàn)明顯器質(zhì)性心腦血管疾病，3例患者心電圖均

12、可見Ⅰ型Brugada波改變（V1-3導聯(lián)至少一個導聯(lián)呈現(xiàn)完全性右束支傳導阻滯并ST段下斜型抬高的“帳篷樣”改變，同時伴有T波倒置），患者家族史調(diào)查均無陽性發(fā)現(xiàn)，心內(nèi)電生理檢查誘發(fā)心室顫動。其診斷標準依據(jù)2005年ESC發(fā)布的有關Brugada綜合征的專家共識確立診斷:若在排除其他繼發(fā)因素（藥物、低溫、急性前壁心肌梗死等）后，患者自發(fā)或經(jīng)藥物誘發(fā)出現(xiàn)Ⅰ型Brugada心電圖模式的情況下，同時滿足下列至少一項條件時，即可診斷為BrS:

13、r>　　 ①記錄到患者出現(xiàn)多形性室性心動過速或心室顫動;
　　 ②電生理檢查可誘發(fā)患者出現(xiàn)上述心律失常;
　　 ③患者既往有暈厥或夜間瀕死樣呼吸病史;
　　 ④家族中有成員出現(xiàn)Ⅰ型Brugada心電圖;
　　 ⑤家族中有成員在45歲以前發(fā)生猝死。
　　 入選健康體檢患者103例作為對照研究組，對照組入選標準為:除不符合Brugda綜合征診斷標準外:
　　 (1)經(jīng)病史詢問無暈厥、抽搐及室

14、性心律失常等病史，家族中無猝死病史;
　　 (2)排除心房纖顫(AF)、擴張性心肌病(DCM)、長QT間期綜合征(LQTS)、病竇綜合癥(SSS)、房室傳導阻滯(AVB)及左室致密化不全（LVNC）等已經(jīng)證實與SCN5A基因異常相關的疾病。以上研究對象均獲知情同意。
　　 方法:
　　 用EDTA抗凝管留取各受試對象的全血每人4ml，至于-20℃冰箱內(nèi)保存，用DNA提取試劑盒針對先證患者的血液樣本抽提白細胞全基因

15、組DNA，將所得DNA提取物采用聚合酶鏈反應(PCR)進行基因擴增，共設計34對引物，分別擴增SCN5A基因的28個外顯子。PCR反應體系如下:采用Platinum(R) Taq反應體系共25uL，除了1uL模板DNA，其余24uL的Supermix組成為:10×PCR緩沖液2.5uL，2.5mM dNTP混合液2uL，50mM MgC120.75uL，5uM上游及下游引物各1uL，Platinum(@) Taq DNA聚合酶0.2uL

16、，其余加入滅菌蒸餾水補足體積。上述反應體系的擴增條件為:94℃預變性5min，94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s，經(jīng)過35個循環(huán)后，再以72℃5min延伸，終末以4℃保存。PCR完成后采用1.5％的瓊脂糖進行電泳鑒定，不理想者再對反應體系及條件進行優(yōu)化，直到達到最佳效果。由invitrogen生物有限公司采用3730XL型DNA測序儀對產(chǎn)物進行直接測序。測序結(jié)果應用Chromas軟件進行BLAST同源比較，若有堿基改變

17、，在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中進行查找，看既往是否已經(jīng)對變異位點進行公布，同時找出是否存在氨基酸序列的改變。若發(fā)現(xiàn)存在氨基酸改變，則以同樣引物擴增變異點所在外顯子，在103個健康者中篩套用以排除遺傳多態(tài)性可能。
　　 結(jié)果:
　　 在3例患者中，除發(fā)現(xiàn)一些已經(jīng)公布的同義多態(tài)性位點外，在1號患者的20號外顯子上發(fā)現(xiàn)導致氨基酸編碼改變的堿基替換，該位點由鳥嘌呤(G)變?yōu)橄汆堰?A)，導致鈉通道α亞單位蛋白一級結(jié)構(gòu)的1192位氨

18、基酸密碼子由CGG[精氨酸Arg(R)]變?yōu)镃AG[谷氨酰胺Gln(Q)]，在103例健康者體檢中發(fā)現(xiàn)1例患者攜帶此變異位點（1例/103例，0.0097），且在NCBI中SCN5A基因SNP數(shù)據(jù)庫中未見公布，但曾有學者在2002年報道，同樣變異位點在日本Brugada綜合征患者中存在。
　　 結(jié)論:
　　 1、中國人Brugada綜合征患者編碼心臟鈉通道蛋白α亞基的SCN5A基因同樣存在G3769A變異，與之相應的氨基