Brugada綜合征患者心臟鈉通道蛋白α亞基編碼基因檢測(cè)及致病機(jī)理探討.pdf

1、研究背景:
　　 Brugada綜合征(Brugada Syndrome)自1992年被西班牙學(xué)者Brugada兩兄弟報(bào)道以來(lái)，世界各地學(xué)者對(duì)其的認(rèn)識(shí)程度也不斷加深，它是一種以右胸導(dǎo)聯(lián)ST段抬高為特征，并且經(jīng)常伴有心臟不同水平的傳導(dǎo)延緩，具有發(fā)生致命性室性心律失常的潛在風(fēng)險(xiǎn)或者家族史中有猝死病史等為特點(diǎn)的遺傳性心律失常疾病。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)最小的患者為幾個(gè)月大的嬰兒，而最大的患者高達(dá)84歲，但大多數(shù)典型的Brugada綜合征首次

2、發(fā)病多發(fā)生于患者的30-40歲期間，而男性發(fā)病率明顯高于女性，是導(dǎo)致青年男子猝死的重要病因。據(jù)估計(jì)，Brugada綜合征占全部猝死病因的4-12％，而在沒(méi)有器質(zhì)性心臟病的猝死病例中，Brugada綜合征患者比例高達(dá)20％。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Brugada綜合征全球發(fā)病率大約為5/10000，有明確臨床表現(xiàn)的Brugada綜合征在西方國(guó)家的發(fā)病率為1/5000-10000，東南亞及日本地區(qū)發(fā)病率為0.12-0.14％。值得一提的是，在東南亞地區(qū)

3、，Brugada綜合征導(dǎo)致的青年人猝死率僅次于交通事故致死率，而成為該地區(qū)年輕男子的第二大“殺手”。
　　 近年來(lái)，借助當(dāng)今日新月異迅猛發(fā)展的分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等領(lǐng)域的新技術(shù)，世界各地學(xué)者針對(duì)發(fā)生于“健康”人群的猝死患者展開了深入細(xì)致的研究，Brugada綜合征的神秘面紗已經(jīng)被學(xué)者們逐漸揭開。研究發(fā)現(xiàn)，Brugada綜合征和先天性QT間期延長(zhǎng)綜合征(LQTS)一樣，是一種編碼心臟離子通道蛋白的基因發(fā)生異常從而導(dǎo)致的遺傳性心律

4、失常疾病，其遺傳方式為常染色體顯性遺傳，但表現(xiàn)型受到多種因素（發(fā)熱，飲酒，基因多態(tài)性等）影響而導(dǎo)致其具有不完全外顯的特征。自1998年美國(guó)學(xué)者Chen等發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)導(dǎo)致BrS發(fā)病的相關(guān)基因——編碼心臟鈉離子通道蛋白α亞基的基因(SCN5A)開始，到目前為止，在Brugada綜合征患者的SCN5A基因上共發(fā)現(xiàn)100余個(gè)可能與之發(fā)病有關(guān)系的點(diǎn)突變，學(xué)者們對(duì)部分突變已經(jīng)展開了功能表達(dá)研究，確定了它們的致病作用。
　　 SCN5A基因位

5、于人類三號(hào)染色體上，負(fù)責(zé)編碼心臟電壓門控性鈉通道蛋白α亞基，該亞基共2016個(gè)氨基酸，在細(xì)胞膜上形成4個(gè)類似的同源結(jié)構(gòu)域(DI-DIV)，每個(gè)區(qū)域由6個(gè)跨膜片段(S1-S6)組成，各區(qū)連接段在胞內(nèi)形成一個(gè)叫P-Loop的結(jié)構(gòu)，4個(gè)區(qū)的P-Loop結(jié)構(gòu)形成一個(gè)供鈉通道流入的孔。研究表明，該基因缺陷影響鈉離子通道蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致瞬時(shí)外向鉀離子電流(Ito)絕對(duì)或相對(duì)增強(qiáng)，使得心室肌外層復(fù)極1期末切跡加深，心肌細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)作電位平臺(tái)期后，

6、心內(nèi)外層復(fù)極時(shí)同一時(shí)間跨壁電壓差持續(xù)存在導(dǎo)致體表心電圖的ST段持續(xù)抬高。而Ito離子流強(qiáng)弱程度導(dǎo)致Brugada波呈現(xiàn)不同形態(tài)，在Ito離子流較弱時(shí)， T波直立，心電圖ST段呈現(xiàn)“馬鞍形”抬高;反之則出現(xiàn)帳篷樣改變伴T波倒置。而同時(shí)1期復(fù)極末切跡過(guò)深使得動(dòng)作電位2期不但內(nèi)外層心肌存在跨壁電壓差，并且在外層各部分之間存在復(fù)極離散，造成2相折返，引發(fā)室性心律失常。
　　 近些年來(lái)，基于對(duì)Brugada綜合征發(fā)病機(jī)制研究的越來(lái)越清晰化

7、，在各國(guó)學(xué)者共同努力之下，在針對(duì)Brugada綜合征的分子遺傳學(xué)研究方面取得了突飛猛進(jìn)的成果，不斷發(fā)現(xiàn)其他幾個(gè)相關(guān)基因，如GPD1-L、SCN1b、SCN3b、CACNA1C、CACNBβ2b、KCNE3和KCNH2。2011HRS/EHRA新公布的針對(duì)遺傳性離子通道病的基因檢測(cè)的專家共識(shí)明確指出:目前發(fā)現(xiàn)Brugada綜合征的致病基因至少牽涉8個(gè)基因。SCN5A基因占了基因型陽(yáng)性的Brugada綜合征病例的絕大部分(＞75％)。然而，

8、在對(duì)那些具有明確臨床表現(xiàn)的Brugada綜合征患者進(jìn)行基因檢測(cè)時(shí)，SCN5A基因異常的檢出率僅為25％。尚有大部分(＞65％)的Brugada綜合征患者不能確定其致病基因。這表明，尚有其他基因可能導(dǎo)致出現(xiàn)Brugada綜合征，由此看來(lái)，目前我們對(duì)Brugada綜合征致病基因的認(rèn)識(shí)還十分膚淺，僅僅是冰山一角，所以Brugada綜合征致病基因研究任重而道遠(yuǎn)。正因如此，該共識(shí)也推薦對(duì)確診為Brugada綜合征的患者及其家屬進(jìn)行以SCN5A基因

9、為主兼顧其他基因的全面基因，一方面明確患者的致病位點(diǎn)，另一方面有利于發(fā)現(xiàn)尚未報(bào)道的新基因位點(diǎn)，為此，美國(guó)心、肺、血研究所(NHLBI)和少見病辦公室(ORD)于2006年9月也聯(lián)合召開了專題研討會(huì)議，建議加強(qiáng)遺傳性離子通道病的研究，推動(dòng)科研以期改進(jìn)遺傳性心律失常疾病的診斷和治療。目前，遺傳性心律失常的遺傳學(xué)研究已經(jīng)成為當(dāng)今心律失常學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，它不但能揭示心律失常背后的本質(zhì)，而且能為臨床決策提供強(qiáng)有力的指導(dǎo)證據(jù)。
　　 目的

10、:
　　 我們以因不明原因暈厥來(lái)南方醫(yī)院心內(nèi)科就診并依據(jù)國(guó)際通用準(zhǔn)則確診為Brugada綜合征的3名患者作為研究對(duì)象，建立臨床資料，抽取其外周全血樣本，提取白細(xì)胞中全基因組DNA，以SCN5A基因?yàn)楹蜻x基因，取用DNA提取產(chǎn)物對(duì)其28個(gè)外顯子部分進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物直接測(cè)序分析，明確患者是否攜帶SCN5A基因變異位點(diǎn)，有助于發(fā)現(xiàn)致中國(guó)人群發(fā)生Brugada綜合征新的基因變異位點(diǎn)，進(jìn)一步明確其致病原因，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)探討其致病機(jī)

11、理，豐富我們對(duì)中國(guó)人群中Brugada綜合征發(fā)病的分子遺傳學(xué)的認(rèn)識(shí)。
　　 研究對(duì)象:
　　 全部研究對(duì)象均來(lái)自2009年1月-2011年1月在南方醫(yī)院心內(nèi)科就診并確診為Brugada綜合征的住院患者，3名患者均為男性，年齡32-70歲，3例患者均接受血生化、心肌酶譜、肌鈣蛋白、胸片、腦電圖、頭顱CT及超聲心動(dòng)圖等檢查，45歲以上患者加行冠脈造影檢查，所有患者均有暈厥病史但并未發(fā)現(xiàn)明顯器質(zhì)性心腦血管疾病，3例患者心電圖均

12、可見Ⅰ型Brugada波改變（V1-3導(dǎo)聯(lián)至少一個(gè)導(dǎo)聯(lián)呈現(xiàn)完全性右束支傳導(dǎo)阻滯并ST段下斜型抬高的“帳篷樣”改變，同時(shí)伴有T波倒置），患者家族史調(diào)查均無(wú)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，心內(nèi)電生理檢查誘發(fā)心室顫動(dòng)。其診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2005年ESC發(fā)布的有關(guān)Brugada綜合征的專家共識(shí)確立診斷:若在排除其他繼發(fā)因素（藥物、低溫、急性前壁心肌梗死等）后，患者自發(fā)或經(jīng)藥物誘發(fā)出現(xiàn)Ⅰ型Brugada心電圖模式的情況下，同時(shí)滿足下列至少一項(xiàng)條件時(shí)，即可診斷為BrS:

13、r>　　 ①記錄到患者出現(xiàn)多形性室性心動(dòng)過(guò)速或心室顫動(dòng);
　　 ②電生理檢查可誘發(fā)患者出現(xiàn)上述心律失常;
　　 ③患者既往有暈厥或夜間瀕死樣呼吸病史;
　　 ④家族中有成員出現(xiàn)Ⅰ型Brugada心電圖;
　　 ⑤家族中有成員在45歲以前發(fā)生猝死。
　　 入選健康體檢患者103例作為對(duì)照研究組，對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)為:除不符合Brugda綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)外:
　　 (1)經(jīng)病史詢問(wèn)無(wú)暈厥、抽搐及室

14、性心律失常等病史，家族中無(wú)猝死病史;
　　 (2)排除心房纖顫(AF)、擴(kuò)張性心肌病(DCM)、長(zhǎng)QT間期綜合征(LQTS)、病竇綜合癥(SSS)、房室傳導(dǎo)阻滯(AVB)及左室致密化不全（LVNC）等已經(jīng)證實(shí)與SCN5A基因異常相關(guān)的疾病。以上研究對(duì)象均獲知情同意。
　　 方法:
　　 用EDTA抗凝管留取各受試對(duì)象的全血每人4ml，至于-20℃冰箱內(nèi)保存，用DNA提取試劑盒針對(duì)先證患者的血液樣本抽提白細(xì)胞全基因

15、組DNA，將所得DNA提取物采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行基因擴(kuò)增，共設(shè)計(jì)34對(duì)引物，分別擴(kuò)增SCN5A基因的28個(gè)外顯子。PCR反應(yīng)體系如下:采用Platinum(R) Taq反應(yīng)體系共25uL，除了1uL模板DNA，其余24uL的Supermix組成為:10×PCR緩沖液2.5uL，2.5mM dNTP混合液2uL，50mM MgC120.75uL，5uM上游及下游引物各1uL，Platinum(@) Taq DNA聚合酶0.2uL

16、，其余加入滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積。上述反應(yīng)體系的擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)后，再以72℃5min延伸，終末以4℃保存。PCR完成后采用1.5％的瓊脂糖進(jìn)行電泳鑒定，不理想者再對(duì)反應(yīng)體系及條件進(jìn)行優(yōu)化，直到達(dá)到最佳效果。由invitrogen生物有限公司采用3730XL型DNA測(cè)序儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Chromas軟件進(jìn)行BLAST同源比較，若有堿基改變

17、，在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行查找，看既往是否已經(jīng)對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行公布，同時(shí)找出是否存在氨基酸序列的改變。若發(fā)現(xiàn)存在氨基酸改變，則以同樣引物擴(kuò)增變異點(diǎn)所在外顯子，在103個(gè)健康者中篩套用以排除遺傳多態(tài)性可能。
　　 結(jié)果:
　　 在3例患者中，除發(fā)現(xiàn)一些已經(jīng)公布的同義多態(tài)性位點(diǎn)外，在1號(hào)患者的20號(hào)外顯子上發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致氨基酸編碼改變的堿基替換，該位點(diǎn)由鳥嘌呤(G)變?yōu)橄汆堰?A)，導(dǎo)致鈉通道α亞單位蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的1192位氨

18、基酸密碼子由CGG[精氨酸Arg(R)]變?yōu)镃AG[谷氨酰胺Gln(Q)]，在103例健康者體檢中發(fā)現(xiàn)1例患者攜帶此變異位點(diǎn)（1例/103例，0.0097），且在NCBI中SCN5A基因SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中未見公布，但曾有學(xué)者在2002年報(bào)道，同樣變異位點(diǎn)在日本Brugada綜合征患者中存在。
　　 結(jié)論:
　　 1、中國(guó)人Brugada綜合征患者編碼心臟鈉通道蛋白α亞基的SCN5A基因同樣存在G3769A變異，與之相應(yīng)的氨基