家族性房顫綜合征致病基因的鑒定.pdf

1、心房顫動(dòng)(AF)是指心房快速的無規(guī)則的激動(dòng)和收縮，它是臨床上最常見的一類心律失常。隨著年齡的增長房顫的發(fā)生呈逐年上升趨勢，在65歲以上的人群中6％的人患有此類疾病。房顫可引起血栓栓塞、心動(dòng)過速造成的心肌病、心力衰竭以及心室功能異常等嚴(yán)重并發(fā)癥。它給醫(yī)療護(hù)理體系帶來了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。房顫的離子特性在決定心律失常的發(fā)生和特點(diǎn)方面扮演了重要的角色。持續(xù)性房顫同心房的電重構(gòu)有關(guān)。L型鈣電流的降低和內(nèi)向整流性鉀電流及乙酰膽堿敏感性鉀電流的升高是

2、房顫發(fā)生與持續(xù)的重要因素。房顫的發(fā)生也呈家族聚集傾向，這就提示我們某些個(gè)體的心律失常同遺傳因素有關(guān)。一些家族性房顫的致病基因被定位在了染色體10q22和6q14-16，新的基因定位也在不斷的被發(fā)現(xiàn)。2003年在一個(gè)具有早發(fā)房顫特征的家系中，發(fā)現(xiàn)鉀離子通道KCNQ1基因的突變與房顫有關(guān)；隨后的研究又發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與房顫發(fā)生有關(guān)的基因，分別為KCNE2和KCNJ2。本實(shí)驗(yàn)室最近獲得了一個(gè)具有家族性遺傳特征的房顫家系，本課題擬尋找該家族房顫的致病

3、基因，并對其致病的分子機(jī)制進(jìn)行探討。 第一部分：建立PCR-SSCP方法目的：建立聚合酶鏈-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法，為篩查突變基因做準(zhǔn)備。 方法：(1)預(yù)實(shí)驗(yàn)樣本的選擇：野生型Kir2.3質(zhì)粒和突變型Kir2.3(I2123L)質(zhì)粒。(2)凝膠濃度：PCR結(jié)果的鑒定采用2％的瓊脂糖凝膠，SSCP分析采用12％的非變性聚丙烯酰胺凝膠。(3)顯色方法：瓊脂糖凝膠EB顯色，非變性聚丙烯酰胺凝膠DNA銀染顯色。(4)PCR產(chǎn)物變

4、性比較了三種方法：即堿變性、SDS變性、加入甲酰胺變性上樣液直接變性。(5)實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)凝膠中丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的比例分為A(49∶1)、B(29∶1)兩組，每組再根據(jù)甘油的比例(0％、1％、5％)分三個(gè)小組，即A1、A2、A3和B1、B2、B3。(6)電泳條件：每塊凝膠選擇兩種電泳條件電泳，分別為30mA恒流快速電泳和100V恒流過夜電泳。 小結(jié)：由于SSCP分析的高度敏感性和一些不明白的原因，其結(jié)果在分析時(shí)有一些難度

5、。在本試驗(yàn)中只將它做為一種粗篩的手段，最后的結(jié)論以測序結(jié)果為準(zhǔn)。 第二部分：篩查家族性房顫致病基因目的：尋找該家族性房顫的致病基因，并對其致病的分子機(jī)制進(jìn)行探討。 方法：(1)收集家系資料；(2)對家系成員進(jìn)行臨床診斷；(3)采集血樣提取基因組DNA；(4)構(gòu)建家系系譜；(5)設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增目的片段；(6)采用SSCP方法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行粗篩；(7)若發(fā)現(xiàn)可疑基因則純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序；(8)將測序結(jié)果經(jīng)NC

6、BI(美國國家生物技術(shù)信息中心)GenebankBLAST軟件進(jìn)行對比以發(fā)現(xiàn)可疑突變點(diǎn)；(9)將該點(diǎn)與SNP數(shù)據(jù)庫中收錄的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行比對，以期獲得通道突變信息。 小結(jié)：利用分子生物學(xué)，并結(jié)合遺傳學(xué)、生物信息學(xué)的方法我們在KCNQ1基因上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的與我們掌握的家族性房顫有關(guān)的單點(diǎn)突變，即KCNQ1(P448R)。進(jìn)一步的通道功能研究將確證該突變是否為導(dǎo)致房顫發(fā)生的分子基礎(chǔ)。 結(jié)論: 1.SSCP是一種簡單快