甲真菌病甲組織DNA提取方法及AP-PCR快速診斷的初步研究.pdf

1、本文旨在尋求一種快速高效提取組織中病原真菌DNA的方法，以及一種適用的快速診斷甲真菌病的方法，更好的服務(wù)于臨床。 目的：1.探討一種快速高效提取甲組織中致病真菌DNA的方法；2.采用AP-PCR法快速診斷甲真菌病。 材料與方法：25例臨床確診甲真菌病患者的甲粉標(biāo)本，直接鏡檢及真菌培養(yǎng)均為陽性，1年內(nèi)未接受系統(tǒng)抗真菌治療。相應(yīng)的培養(yǎng)菌株，紅色毛癬菌22株，白念株菌3株，均由本科真菌室提供。另有兩例無全身性和手足甲疾病的正常

2、青年人的甲粉作為對(duì)照，直接鏡檢及真菌培養(yǎng)均為陰性。 75﹪酒精消毒病甲三次，收集標(biāo)本后-20℃凍存，每份標(biāo)本取少許于沙氏瓊脂培養(yǎng)基(含放線菌酮和慶大霉素)26℃培養(yǎng)3-4周，后轉(zhuǎn)種于沙氏液基上26℃培養(yǎng)3周。選10份60mg左右的甲粉標(biāo)本平均分為三份，另取3份100mg相應(yīng)培養(yǎng)菌株的組織，分別采用異硫氰酸胍法、玻璃珠法、CTAB微量提取法(以下簡稱微量法)提取基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳法、分光光度計(jì)法及PCR法檢測比較DNA

3、的濃度和純度；另15份標(biāo)本及其培養(yǎng)株以微量法提取DNA后，以O(shè)PAA11為引物擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外線燈照相，比較標(biāo)本及菌株提取DNA的反應(yīng)產(chǎn)物的帶型。 結(jié)果：1.微量法每100mg培養(yǎng)組織可獲得DNA50ug，DNA鏈無明顯斷裂，且DNA純度較好；玻璃株法每100mg培養(yǎng)組織可獲得30ugDNA，但DNA鏈有部分?jǐn)嗔?；異硫氰酸胍法?00mg培養(yǎng)組織可獲得約10ugDNA，DNA鏈較完整。每20mg同一患者的甲粉提取

4、真菌DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)的陽性率，微量法為100﹪，玻璃珠法為70﹪，異硫氰酸胍法為50﹪。2.AP-PCR反應(yīng)后，每份標(biāo)本DNA的產(chǎn)物與相應(yīng)菌株DNA的產(chǎn)物的電泳帶型完全一致；紅色毛癬菌的帶型為2.2、1.7、1.3、0.9、0.7kb，其共有帶型為1.7、1.3、0.9、0.7kb；白念株菌的帶型為1.5、1.0、0.3kb，兩者帶型明顯不同。 結(jié)論：1.CTAB微量提取法具有效率高，DNA純度好，省時(shí)經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，明顯優(yōu)于