羊泰勒蟲病PCR診斷方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、羊泰勒蟲是一類寄生于羊血液細(xì)胞的泰勒科泰勒屬的血液原蟲，由其引起的疾病總稱羊泰勒蟲?。∣vine and caprine theileriosis）。羊泰勒蟲病危害嚴(yán)重，可引起羔羊和外地引進(jìn)羊大量死亡，使慢性發(fā)病的山羊和綿羊生長(zhǎng)發(fā)育變緩，產(chǎn)肉量和產(chǎn)毛量顯著下降，從而給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的診斷方法主要有血液涂片染色鏡檢、間接熒光抗體試驗(yàn)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，但這些方法均有不同程度的缺點(diǎn)。因此有必要建立一種快速、敏感、特異診斷

2、方法，以便進(jìn)行羊泰勒蟲病的早期診斷和預(yù)防。
　　本研究根據(jù)GenBank中報(bào)道的羊泰勒蟲18S rRNA和表面蛋白基因序列，利用Oligo6.0和Primer Premier5.0軟件分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，擴(kuò)增出長(zhǎng)為671bp和610bp兩條特異性基因片斷，并分別克隆到pGEM-T Easy載體上，經(jīng)酶切分析、PCR鑒定后，篩選陽性克隆的重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列分析及同源性比較。結(jié)果表明，測(cè)得的羊泰勒蟲吉林分離株18S rRNA

3、基因序列與羊泰勒蟲基因序列China1（AY492086）、China2（AY262121）同源性分別為100％和96.0%，與國外報(bào)道的綿羊泰勒蟲（AY260172）同源性為97.0%，與山羊泰勒蟲（AF081135）同源性為96.4%；測(cè)得的羊泰勒蟲吉林分離株表面蛋白基因與羊泰勒蟲表面蛋白China1的同源性為99.5%。
　　在以上研究?jī)?nèi)容的基礎(chǔ)上，建立了檢測(cè)羊泰勒蟲18S rRNA基因和表面蛋白基因的兩種常規(guī)PCR診斷方法

4、和一種檢測(cè)羊泰勒蟲18S rRNA基因半套式PCR診斷方法。并通過平行檢測(cè)51份羊血液樣本，對(duì)3種PCR方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明半套式PCR方法陽性檢出率優(yōu)于兩種常規(guī)PCR方法。
　　本研究建立的半套式PCR方法可檢測(cè)到0.016fg的質(zhì)粒 DNA含量，比常規(guī)PCR方法敏感100倍。所建立的半套式PCR具有敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，完全實(shí)用于羊泰勒蟲病的早期診斷及疫情檢測(cè)。
　　應(yīng)用所建立的半套式PCR方法對(duì)吉林省