活化T細胞核轉(zhuǎn)錄因子C4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜血管生成中的作用.pdf

1、研究目的：1.通過免疫組化單染及雙染方法分別從組織水平及細胞水平了解NFATc4在RA關(guān)節(jié)滑膜組織及血管內(nèi)皮細胞中的表達情況。 2.通過分析滑膜NFATc4的表達與滑膜各項病理學(xué)評分之間的關(guān)系，了解NFATc4與RA滑膜病理學(xué)改變的關(guān)系。 3.通過分析滑膜NFATc4的表達與滑膜病理血管生成評分、滑膜微血管計數(shù)、滑膜VEGF表達之間的關(guān)系，了解NFATc4在RA滑膜血管生成中的可能作用。 4.通過分析滑膜血管內(nèi)皮

2、細胞中NFATc4的表達與滑膜病理血管生成評分、滑膜微血管計數(shù)及滑膜VEGF表達之間的關(guān)系，了解RA滑膜血管內(nèi)皮細胞表達的NFATc4在滑膜血管生成中的意義。 材料和方法：1.滑膜標本來源及分組43例滑膜標本，分為四組，其中RA組11例，OA組17例，TA組6例，正常對照組9例。所有滑膜標本均取自關(guān)節(jié)鏡手術(shù)及關(guān)節(jié)置換術(shù)。 2.標本處理滑膜組織離體后立即用4℃的10％中性福爾馬林固定，24小時后予常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切

3、片，切片厚度為4μm，分別做HE染色和免疫組化染色。 3.免疫組化方法3.1免疫組化單染方法采用過氧化物酶標記的鏈霉親和素(SP)免疫組化方法進行單染，一抗包括NFATc4(工作濃度為1：100)、VEGF(工作濃度為1：250)和CD31(內(nèi)皮細胞特異性抗體，工作濃度為1：30)。 3.2免疫組化雙染方法先采用SP免疫組化法行NFATc4染色，然后再用堿性磷酸酶(AP)免疫組化法行CD31染色。 4.結(jié)果判斷4

4、.1病理學(xué)評分光鏡下觀察滑膜HE染色結(jié)果。在40×高倍鏡下，隨機選擇5個有完整滑膜組織的視野進行半定量評分。計算5個視野評分的平均值作為最終評分。評分內(nèi)容包括滑膜襯里層增生、襯里下層炎癥細胞浸潤及血管生成的情況。襯里層評分：少于3層(0分)，3～4層(1分)，5～6層(2分)，6層以上(3分)。炎癥細胞浸潤評分：沒有浸潤(0分)，炎癥細胞散在浸潤(1分)，炎癥細胞彌漫浸潤(2分)，形成淋巴濾泡或生發(fā)中心(3分)。血管生成評分：正常(0分

5、)，輕度(1分)，中度(2分)，重度(3分)。將以上三項評分累計即為該片病理學(xué)總評分，每張片最高累計得分為9分。 4.2免疫組化結(jié)果判斷4.2.1滑膜NFATc4染色結(jié)果判斷NFATc4陽性細胞的胞漿或胞核呈棕黃色或棕褐色，根據(jù)陽性細胞的比例和染色強度進行半定量評分。在40×高倍鏡下，隨機選擇5個有完整滑膜組織的視野分別進行滑膜襯里層、襯里下層及細胞核陽性染色評分，計算5個視野評分的平均值作為最終評分。將某片襯里層和襯里下層評分

6、相加為該片滑膜總評分。滑膜襯里層及襯里下層具體評分方法如下：先按陽性細胞比例將無、1％～25％、26％～50％、51％～75％、76％～100％分別計為0～4分；再按染色強度將無、弱、中、強分別計為0～3分，最后綜合兩部分得分。如某片襯里層有50％的細胞呈中等陽性染色，則該片襯里層計分為2×2=4分；襯里下層有20％的細胞呈弱陽性，則該片襯里下層計分為：1×2=2；該片滑膜總得分為4+2=6。 細胞核陽性染色具體評分方法為：分別

7、計算襯里層、襯里下層陽性細胞中胞核染色陽性的比例。 4.2.2滑膜VEGF染色結(jié)果判斷VEGF陽性細胞的胞漿呈棕黃色或棕褐色。按上述方法根據(jù)陽性細胞的比例和染色強度對滑膜襯里層、襯里下層VEGF染色進行半定量評分。 4.2.3滑膜CD31染色結(jié)果判斷及滑膜微血管計數(shù)CD31陽性細胞的胞漿呈棕黃色或棕褐色。根據(jù)CD31陽性染色的小血管進行滑膜微血管計數(shù)(MVC)。在4×視野下找出5個陽性內(nèi)皮細胞密集的區(qū)域，然后每個區(qū)域在2

8、0×視野(0.74mm2)下計數(shù)，取5個區(qū)域的平均值為最終MVC值。注意：①直徑大于或等于8個紅細胞直徑的血管或管壁有平滑肌的血管不作為微血管；②獨立的典型血管內(nèi)皮細胞著色，但尚未形成管腔，可作為新生微血管來計數(shù)；③聚集成簇的內(nèi)皮細胞或微血管作為一個單位計數(shù)。 4.2.4免疫組化雙染結(jié)果判斷及滑膜血管內(nèi)皮細胞NFATc4的免疫組化評分NFATc4陽性細胞的胞漿或胞核呈棕黃色或棕褐色，CD31陽性細胞的胞漿呈淡紅色或紫紅色，NFA

9、Tc4及CD31均為陽性的細胞胞漿呈深紅色或黑色。 滑膜血管內(nèi)皮細胞NFATc4的表達采用定量評分。首先在低倍鏡下找出血管較密集的5個區(qū)域，然后在40×視野下計算每個區(qū)域CD31陽性內(nèi)皮細胞中NFATc4同時陽性的內(nèi)皮細胞的比例。取5個區(qū)域的平均值為最后評分。 4.統(tǒng)計學(xué)處理所有的數(shù)據(jù)處理均采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。正態(tài)分布資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示；多組問均數(shù)的比較采用單因素方差分析；半定量資

10、料兩組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗；對兩組數(shù)據(jù)間的相關(guān)性進行Spearman等級相關(guān)分析。顯著性水準為0.05。 小結(jié)：1.RA滑膜襯里下層NFATc4的表達較非RA滑膜及正常滑膜明顯增多，其表達程度與滑膜炎癥細胞浸潤呈顯著正相關(guān)，提示RA滑膜襯里下層NFATc4表達上調(diào)且與滑膜炎癥細胞浸潤密切相關(guān)。 2.RA滑膜襯里下層NFATc4的表達與滑膜病理血管生成評分、滑膜微血管計數(shù)及滑膜襯里下層VEGF的表達呈