自噬在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維樣細(xì)胞中抗凋亡作用.pdf

1、目的：探索不同濃度的TNF-α對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維樣細(xì)胞自噬和凋亡的影響。
　　方法：建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維樣細(xì)胞（RA-HFLS）和正常人滑膜成纖維樣細(xì)胞（HFLS）培養(yǎng)與凍存體系，應(yīng)用western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ，通過(guò)腺病毒將 mRFP-GFP-LC3串聯(lián)熒光蛋白轉(zhuǎn)染到兩組細(xì)胞中，在共聚焦顯微鏡下計(jì)算熒光斑點(diǎn)以表示自噬水平。通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡水平。給

2、予一定濃度梯度的TNF-α刺激兩組細(xì)胞后，再次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組自噬與凋亡水平。
　　結(jié)果：western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)，RA-HFLS組本底LC3-Ⅱ表達(dá)水平是HFLS組的2.1倍。給予30ng/ml人重組TNF-α刺激48小時(shí)后，兩組細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)水平均上升，RA-HFLS組略高于HFLS組。共聚焦顯微鏡檢測(cè)mRFP-GFP-LC3串聯(lián)熒光蛋白與western blot結(jié)果一致。分別給

3、予0、10ng/ml、40ng/ml、100ng/ml的TNF-α刺激兩組細(xì)胞，可發(fā)現(xiàn)隨著TNF-α濃度增高，兩組細(xì)胞自噬均上升，RA-HFLS組略高于 HFLS組，RA-HFLS組自噬水平與TNF-α濃度不成正比（r2=0.161,P>0.05），HFLS組呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性（r2=0.457,P<0.05）。在不同濃度的TNF-α刺激下，HFLS組凋亡水平均高于RA-HFLS組，兩組凋亡水平與TNF-α不呈濃度依賴性（P>0.0

4、5）。若同時(shí)給予TNF-α和5mM的3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA），RA-HFLS組和HFLS組凋亡水平均升高。在TNF-α刺激濃度為0、10ng/ml、40ng/ml時(shí)，HFLS(3-MA+TNF-α)組凋亡水平高于RA-HFLS(3-MA+TNF-α)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。RA-HFLS組自噬水平與其凋亡水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.264）,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而HFLS組自噬水