血管內(nèi)皮生長因子在大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用機制初探.pdf

1、目的:
　　 1、建立DA(RT1a)-LEW(RT11)大鼠原位肝移植(ROLT)急性排斥反應(yīng)模型,觀察DA(RT1a)-LEW(RT11)大鼠原位肝移植后移植肝臟能否產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。監(jiān)測受者大鼠生存及生化或血清學(xué)指標來評價移植肝功能,排斥由組織學(xué)確定。2、后用免疫組化法分別檢測VEGF、CD68(+)macrophages、CD3(+)T cells；用RT—PCR法分別檢測VEGF、IP-10在模型各亞組受體中用藥前后肝

2、臟及脾臟組織中的表達；用ELISA方法分別檢測用藥前后VEGF在其血清中的水平,以了解VEGF的表達或水平狀況是否與炎性細胞浸潤,新生血管生成,T細胞,移植物存活時間有關(guān)系及關(guān)系如何。通過以上實驗,試圖初步探索VEGF在大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用機制。
　　 方法:
　　 1、近交系DA(RT1a)-LEW(RT11)大鼠原位肝臟移植急性排斥反應(yīng)模型的建立。采用經(jīng)典的由Ka(m)ada和Calne等開創(chuàng)的二袖套法

3、進行大鼠原位肝移植,具體步驟可參見其論文(Surgery1983 Jan;93:64—9)。實驗分二組:(1)、DA(RT1a)-LEW(RT11)大鼠間移植為同種異體移植急性排斥組(acute allograft rejectionOLT,OLTa,n=40)；LEW(RT11)-DA(RT1a)大鼠間移植為同系移植耐受對照組(syngeneic OLT,OLTs,n=40)；(2)、兩組各取10只觀察存活,按移植術(shù)后1,3,7天分亞

4、組,每個亞組10只大鼠作進一步實驗用。通過監(jiān)測受者大鼠生存及生化或血清學(xué)指標來評價移植肝功能,排斥由組織學(xué)確定。
　　 2、VEGF在受體血清中的水平測定。將大鼠DA(RT1a)-LEW(RT11)同種異體移植急性排斥反應(yīng)模型對受體用藥的不同分為二組,每個組40只大鼠:分別為A.實驗組:VEGF單克隆抗體,經(jīng)腹腔注入受體大鼠體內(nèi)。B.對照組:不用藥。根據(jù)移植后時間的不同,上述實驗組又各分為移植術(shù)后1,3,7天亞組,每個亞組10只

5、大鼠。各亞組受體大鼠于術(shù)后按上述預(yù)定的1,3,7天數(shù)殺死,分別從下腔靜脈取血2ml,用雙抗體夾心ELISA法測定各亞組受體大鼠血清中VEGF的水平。
　　 3、分組同“2”。免疫組化法分別檢測VEGF、CD68(+)macrophages、CD3(+)Tcells等各種指標在模型各亞組受體中用藥前后肝臟,脾臟中的表達,目的是為了研究未阻斷VEGF的作用及阻斷VEGF的作用以后在肝臟中VEGF的表達分別和巨噬細胞、T細胞、新生血管

6、、炎性介質(zhì)之間是否有關(guān)系及關(guān)系如何,從而初步揭示VEGF是通過介導(dǎo)匯管區(qū)炎癥細胞浸潤和血管新生的相互作用,而不是通過作用于T細胞而在肝移植急性排斥反應(yīng)中起著促進作用。
　　 4、分組同“2”。用RT—PCR方法分別檢測VEGF、IP-10等各種指標在模型各亞組受體中用藥前后肝臟中的表達,目的是為了進一步從分子基因水平研究未阻斷VEGF的作用及阻斷VEGF的作用以后在肝臟中VEGF的表達分別和各炎性細胞及介質(zhì)之間的相互關(guān)系如何,從

7、而進一步揭示匯管區(qū)炎癥細胞浸潤和血管新生的互動和時間上的重疊才是導(dǎo)致肝移植后急性排斥反應(yīng)的主要機制,為原位肝移植急性排斥反應(yīng)機理提出新的理論解釋。
　　 結(jié)果:
　　 1、DA(RT1a)-LEW(RT11)大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型,肝組織病理改變明顯,表現(xiàn)為肝細胞變性嚴重,有部分灶狀及橋狀壞死,內(nèi)皮細胞腫脹明顯,肝竇顯著充血,明顯擴張,匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤,匯管區(qū)小靜脈、終末肝靜脈及中央靜脈內(nèi)皮下淋巴細胞浸潤,

8、膽管上皮細胞腫脹,結(jié)構(gòu)破壞,變性壞死,肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰。肝臟功能損害進行性加重,1周存活率為30％,達到Banff急性排斥反應(yīng)標準的中、重度水平。而在未使用免疫抑制劑的情況下,LEW(RT11)-DA(RT1a)大鼠原位肝移植后可產(chǎn)生免疫耐受,其1周存活率為70％,病理檢查顯示:肝組織形態(tài)改變輕微,肝細胞和肝血竇內(nèi)皮細胞部分變性腫脹,個別肝細胞壞死,匯管區(qū)輕度擴張及伴有少量炎性細胞浸潤,肝竇輕度充血并伴有少量淋巴細胞浸潤,整個肝小葉結(jié)構(gòu)

9、基本正常。肝功能損害較輕,7天左右基本恢復(fù)到正常。2、在實驗組,肝臟、脾臟組織VEGF、CD68(+)macrophages、IP-10的表達及血漿VEGF水平檢測均較對照組為低(P<0.05),而CD3(+)T cells在兩組中的表達比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3、VEGF表達與受體鼠的存活時間成反比。初步提示血管內(nèi)皮生長因子是通過介導(dǎo)匯管區(qū)炎癥細胞浸潤和血管新生的相互作用而在肝移植急性排斥反應(yīng)中起著促進作用。