CCK-8對(duì)TNFα誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病。成纖維樣滑膜細(xì)胞是滑膜組織的重要組成部分,其分泌高水平促炎性細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子、基質(zhì)蛋白降解酶等[1],持續(xù)刺激滑膜細(xì)胞,作用于滑膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的不同部位,引起細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的持續(xù)激活,從而導(dǎo)致滑膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常以及滑膜細(xì)胞的增殖與凋亡失衡[2],引起關(guān)節(jié)的炎癥和破壞。
　　 TNF-α具有多種生

2、物活性,是一種重要的生理炎性介質(zhì),主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,通過作用于靶細(xì)胞上的獨(dú)特受體結(jié)合而發(fā)生作用。TNF-α是RA發(fā)病機(jī)理中居于重要地位的促炎癥細(xì)胞因子,參與RA的發(fā)生發(fā)展過程,能夠刺激滑膜成纖維細(xì)胞增生及分泌IL-6、粒細(xì)胞.巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、趨化因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶和前列腺素等效應(yīng)分子。因此,針對(duì)TNF-α在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中所起的重要作用,已有TNF-α拮抗劑批準(zhǔn)上市治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。但長(zhǎng)期使用TNF-α阻斷

3、劑易產(chǎn)生抗體及引起感染。八肽膽囊收縮素(cholecystokininoctapeptide,CCK-8)是神經(jīng)肽,具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用。已有研究證實(shí)CCK-8在TNF-α存在的情況下可以抑制膠原性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖,但對(duì)于RA的滑膜細(xì)胞是否具有同樣作用至今尚未見報(bào)道。為了進(jìn)一步研究CCK-8對(duì)治療RA的潛在應(yīng)用價(jià)值,我們觀察了不同濃度的CCK-8對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖的影響。
　　 方 法
　　

4、1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的原代培養(yǎng):在無菌條件下取得新鮮的RA滑膜組織,膠原酶消化法分離純化滑膜成纖維細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)用3-7代細(xì)胞。
　　 2、免疫組化鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維樣滑膜細(xì)胞。
　　 3、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)(MTT)觀察不同濃度的CCK-8對(duì)經(jīng)過TNF-α作用的滑膜細(xì)胞增殖的影響。
　　 4、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)觀察滑膜細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié) 果
　　 1、不同濃度的CCK-8對(duì)TNF-α

5、,誘導(dǎo)的RAFLS增殖的影響
　　 不同濃度的CCK-8預(yù)孵1小時(shí)RA FLS,再加入TNF-α作用48小時(shí)后,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在TNF-α(10ng/ml)存在的情況下,CCK-8濃度為10-6mol/L時(shí),A值為0.286±0.0185,CCK-8濃度為10-7mol/L時(shí),A值為0.375±0.0342,CCK-8濃度為10-5mol/L時(shí),A值為0.372±0.034。當(dāng)CCK-8濃度為10-6mol/L時(shí)A值與對(duì)照

6、組TNF-α(10ng/ml)A值相比差異顯著(P<0.01),與其他濃度的CCK-8組相比差異亦顯著(P<0.01)。CCK-8濃度為10-5mol/L、10-7mol/L時(shí)A值與空白對(duì)照組A值無明顯差異(P>0.05),但與TNF-α組相比差異顯著(P<0.01)。CCK-8對(duì)TNF-α引起的RA FLS增殖的抑制作用,與其劑量無明顯的正相關(guān)效應(yīng),在CCK-8濃度為10-6mol/L時(shí)此種抑制作用最明顯。
　　 2、細(xì)胞凋亡

7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 CCK-8(10-6mol/L)預(yù)孵1小時(shí)RA FLS,再加入TNF-α作用18小時(shí)后,細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果顯示凋亡率為61.62％；單獨(dú)CCK-8作用的FLS,細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果顯示其凋亡率為59.59％；單獨(dú)TNF-α(10ng/ml)作用的FLS,其凋亡率為52.47％。結(jié)果顯示在TNF-α存在的情況下,CCK-8可以促進(jìn)RAFLS凋亡,此外可以拮抗TNF-α對(duì)RAFLS的抗凋亡作用。
　　 結(jié) 論