氟尿嘧啶和長春瑞濱多靶點抗腫瘤作用研究.pdf

1、腫瘤已成為嚴重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，其死亡率在發(fā)達國家居第1位，在發(fā)展中國家居第2位，而且今年發(fā)病率仍呈上升趨勢。因此，近40年來攻克腫瘤就一直是各國政府與科研、醫(yī)療機構(gòu)的主要任務(wù)之一，其中化療作為腫瘤四大常規(guī)治療方法之一，已成為腫瘤治療不可缺的手段。腫瘤化療的根本目的是在保證患者安全的情況下以藥物消滅腫瘤細胞，但是，由于惡性腫瘤細胞與正常細胞間缺少根本性的代謝差異，故目前臨床上所有的抗腫瘤化療藥都不能完全避免對正常組織的損害，

2、而且在多數(shù)情況下造成病人不得不因為這些損害而被迫停藥。因此，如何提高腫瘤組織對化療的敏感性，保護正常組織免受化療的損害從而減輕毒副作用，是目前惡性腫瘤綜合治療研究的一個重要課題。 近年分子腫瘤學(xué)、分子藥理學(xué)、癌癥細胞生物學(xué)的研究進展表明，癌癥是一種至少由2種以上癌基因經(jīng)多階段變化所致的多基因疾病。這不僅為癌癥的防治提供了不少新靶點、新領(lǐng)域，也使抗腫瘤藥物研究從尋找傳統(tǒng)的細胞毒性藥物，逐漸轉(zhuǎn)向針對腫瘤發(fā)病機制不同環(huán)節(jié)，尋找可具有多

3、環(huán)節(jié)作用的新型抗腫瘤藥物。因為目前認為，實體瘤的信號傳導(dǎo)是一個復(fù)雜的、多因素的蛋白網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，抑制單一信號傳導(dǎo)往往不足以遏制腫瘤的發(fā)展。而且多項臨床試驗也顯示，多靶點抑制劑在治療方面優(yōu)于單靶點抑制劑，如ZD6474和中文摘要COX2抑制劑可通過影響數(shù)個分子靶點而發(fā)揮防治腫瘤作用；COX2抑制劑與傳統(tǒng)化療藥聯(lián)用也可增強抗癌效果。既然多靶點抑制劑在治療方面優(yōu)于單靶點抑制劑，既然不同作用機制的化療藥聯(lián)用可增強療效也在于使它們各自的單靶點抑制形成

4、了多靶點抑制，那末，我們就可以將療效肯定、機制明確的常用化療藥，通過正交設(shè)計進行適當(dāng)?shù)呐湮?，并找到既可使它們通過作用于腫瘤信號傳導(dǎo)的不同靶點而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，又不表現(xiàn)各自的毒性的劑量，從而制備出新型多靶點復(fù)方抗腫瘤藥物。這要比尋找新型多靶點作用的抗腫瘤藥物容易得多。因此，有理由相信多靶點腫瘤信號傳導(dǎo)抑制劑將在腫瘤治療中扮演越來越重要的角色，兩種或兩種以上的化療藥物聯(lián)合應(yīng)用也將成為臨床上越來越常用的化療方案。多靶點聯(lián)合阻斷信號傳導(dǎo)是腫

5、瘤治療和藥物開發(fā)的發(fā)展方向。 本研究擬采用MTT法分別測定氟尿嘧啶(5-FU)、順鉑(DDP)、吉西他濱(GEM)和長春瑞濱(VRB)四種已知化療藥物抑制小鼠肝癌H<,22>細胞生長的量效關(guān)系曲線，選取各藥對H<,22>細胞抑制率小于30％的劑量進行不同的配伍，觀察5-FU、DDP、GEM和VRB不同藥物和劑量配伍對小鼠肝癌H<,22>細胞生長的抑制作用，以確定由以上四藥組成新型多靶點復(fù)方抗腫瘤藥物的最佳配伍，并對其進行進一步的

6、體內(nèi)、外抗腫瘤作用和機制的分析。 一、氟尿嘧啶、順鉑、長春瑞濱和吉西他濱抗腫瘤最佳劑量及配伍篩選.目的：尋找5-FU、DDP、GEM、VRB最佳組合方案。 方法：(1) MTT法測定5-FU、DDP、GEM和VRB各藥抑制H<,22>細胞生長的劑量.效應(yīng)曲線，從中選出抑制率低于30％的劑量點。(2)以確定的劑量的5-FU、DDP、GEM和VRB不同配伍組合，MTT法檢測各組合對H<,22>細胞生長的抑制作用，選出最佳組合

7、。 結(jié)果： 1 各藥單用對肝癌H<,22>細胞的生長抑制作用5-FU、DDP、GEM和VRB抑制H<,22>細胞生長的IC<,50>分別為490.79，10.01，0.021，16.49μmol/L。而各藥低于抑制H22細胞生長IC<,30>的劑量：5-FU 為 0.00128、0.0064、0.032、0.16、0.8μmol/L，DDP 為 0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5μmol/L，

8、GEM 為 0.000128、0.00064、0.0032μmol/L，VRB為5×10<'-7>、5×10<'-6>、5×10<'-5>、5×10<'-4>、5×10<'-3>μmol/L。 2 聯(lián)合用藥對肝癌H<,22>細胞生長的抑制作用在各藥物的兩兩組合、三三及四四組合中，以5-FU(0.8μmol/L) +VRB (0.005μmol/L) 和 5-FU (0.8μmol/L)+DDP (5μmol/L) +VRB (0

9、.005μmol/L)組合對H<,22>細胞生長的抑制最為明顯。5-FU (0.8μmol/L) +VRB (0.005μmol/L)對H<,22>細胞生長的抑制率為 40.84％±6.17％，顯著高于5-FU(21.34％±4.26％) 或 VRB(21.1％±11.44％)單獨應(yīng)用(P<0.01)。5-FU (0.8μmol/L) +DDP (5μmol/L)+VRB(0.005μmol/L) 者組合對H<,22>細胞生長的抑制率為

10、41.06％±3.78％，與5-FU+VRB組合比較無明顯差異。因而藥物最佳作用的組合為5-FU (0.8μmol/L) +VRB (0.005μmol/L)。 結(jié)論：5-FU (0.8μmol/L) 和 VRB (0.005μmol/L) 低劑量聯(lián)合應(yīng)用對H<,22>細胞的生長抑制具有顯著協(xié)同作用，有望成為以上四種作用機制不同的抗腫瘤藥物中的最佳配伍。 二、氟尿嘧啶和長春瑞濱協(xié)同抗腫瘤作用及機制研究.目的：探討 5-F

11、U (0.8μmol/L) +VRB (0.005μmol/L)對小鼠肝癌H<,22>細胞體外生長、小鼠體內(nèi)荷瘤生長的抑制作用及其作用機制。 方法：(1) MTT 法測定5-FU+VRB對細胞活性的影響；(2)測定5-FU+VRB對細胞培養(yǎng)上清液中壞死細胞和凋亡細胞LDH泄漏率(LDH)的影響；(3) 丫啶橙/溴化乙錠染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察5-FU+VRB對細胞凋亡的影響：(4) 流式細胞儀分析5-FU+VRB對細胞凋亡

12、和增殖的影響。(5) 觀察5-FU+VRB對小鼠移植H<,22>肝癌腫瘤瘤重，抑制率的影響，觀察5-FU+VRB對胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和白細胞數(shù)等的影響。 結(jié)果：(1) 5-FU+VRB作用48～120h內(nèi)兩藥合用效果均高于兩藥單獨應(yīng)用時(P<0.01，P<0.01)，且72h時作用達最高峰(47.70±5.40％)。(2)LDH 泄漏率(LDH％)：5-FU+VRB組各時間點細胞壞死率(LDHn％)與其他組相比，均無統(tǒng)計學(xué)意義；

13、細胞凋亡率 (LDHa％)隨時間延長而增大，96h、120h、144h、168時，5-FU+VRB顯著高于其他組(P<0.01)。(3)細胞形態(tài)：非凋亡細胞的胞核為綠色熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征。凋亡細胞的胞核呈現(xiàn)為黃色強熒光染色，細胞核染色質(zhì)固縮，體積縮小，早期凋亡細胞還可見典型的胞膜出泡現(xiàn)象，5-FU+VRB組細胞數(shù)量明顯低于其它組。(4)細胞周期、凋亡：H<,22>細胞呈現(xiàn)出明顯的亞二倍體凋亡峰，5-FU+VRB組凋亡率 (40.6

14、5±7.44％)高于空白組(16.71±1.49％)、5-FU 組(22.46±1.90％)、VRB組(21.64±1.98％)(P<0.01，P<0.05，P<0.05)。5-FU+VRB組細胞增殖較其它組顯著下降 (P<0.01，P<0.05，P<0.01)。(5)對荷瘤小鼠的影響：5-FU+VRB高、中兩個劑量對荷瘤小鼠的腫瘤生長有顯著抑制作用，其抑瘤率分別為60.61％和21.21％(P<0.01，P<0.05)。高劑量5-FU