腺病毒介導(dǎo)MC148基因?qū)Ζ纶吇蜃拥霓卓棺饔醚芯?pdf

1、該課題運(yùn)用腺病毒作為真核表達(dá)載體,將MC148基因進(jìn)行體內(nèi)外轉(zhuǎn)染,研究其對(duì)趨化因子的拮抗作用,以期減少移植物內(nèi)白細(xì)胞浸潤(rùn),抑制免疫排斥反應(yīng),并為進(jìn)一步運(yùn)用于基因治療打下基礎(chǔ).在第一部分實(shí)驗(yàn)中,首先從傳染性軟疣病毒中擴(kuò)增MC148基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后,用BamH I、EcoR I內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切并與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒載體pUC19連接.重組載體轉(zhuǎn)染JM109大腸桿菌擴(kuò)增,提取的重組質(zhì)粒進(jìn)一步對(duì)克隆的基因測(cè)序.在第二部分實(shí)驗(yàn)中,將已克隆

2、的MC148基因從重組質(zhì)粒pUC19-MC148上酶切下來(lái),末端添平后與cosmid質(zhì)粒pAxCAwt連接構(gòu)建穿梭質(zhì)粒.將此穿棱質(zhì)粒經(jīng)包裝并擴(kuò)增,提純后與腺病毒DNA-TPC共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,通過(guò)同源重組成功構(gòu)建了Ad-MC148腺病毒重組體,并進(jìn)行了克隆篩選和滴度滴定.在第三部分中,Ad-MC148腺病毒重組體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞大量擴(kuò)增,上清中提純MC148P蛋白并測(cè)定其拮抗β趨化因子MCP-1和RANTES的生物學(xué)活性.在第四部分,以大