攜帶趨化因子CCL5的Ad5-11嵌合型增殖腺病毒對(duì)肝癌殺傷作用的研究.pdf

1、增殖型腺病毒又稱條件復(fù)制型腺病毒或溶瘤病毒，可利用腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞間結(jié)構(gòu)及代謝途徑的差異，靶向性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，最終裂解腫瘤細(xì)胞，同時(shí)能長(zhǎng)效表達(dá)抗腫瘤的外源基因[1]。常用的5型增殖型腺病毒具有可復(fù)制、體積小、彌散能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但也存在感染效率不高及毒副作用強(qiáng)等問(wèn)題。人11型腺病毒(Ad11)屬于B2亞群，與傳統(tǒng)的5型等C組腺病毒載體相比有許多優(yōu)點(diǎn)：血清中的中和抗體陽(yáng)性率較低；與5型腺病毒(Ad5)無(wú)免疫交叉反應(yīng)；感染細(xì)胞

2、不依賴CAR受體，能夠高效感染多種重要的干細(xì)胞及原代腫瘤細(xì)胞；肝臟毒性低，免疫副作用小等[2-3]。用11血清型腺病毒纖毛蛋白的knob和shaft替換傳統(tǒng)5型腺病毒載體纖毛蛋白的knob和shaft，構(gòu)建成的具有嵌合型纖毛蛋白的Ad5/F11腺病毒載體，繼承了Ad11的感染特性，能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR表達(dá)不足的多種重要靶細(xì)胞，尤其是對(duì)腫瘤細(xì)胞及造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等有較高的感染效率[2-3]。
　　 趨化因子是一類在細(xì)胞的生理過(guò)

3、程中發(fā)揮著重要作用的細(xì)胞因子樣蛋白質(zhì)，可趨化白細(xì)胞和免疫細(xì)胞向組織浸潤(rùn)[4-5]。趨化因子在腫瘤生物學(xué)中具有較復(fù)雜的作用和重要意義，將趨化因子導(dǎo)入腫瘤組織，能強(qiáng)化宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)[6-7]。NK細(xì)胞是一種大顆粒淋巴細(xì)胞，英文全稱為”natura.kille.cell”，也稱作”自然殺傷細(xì)胞”，它屬于一種能直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)的特殊的淋巴細(xì)胞系，具有抗腫瘤抗感染免疫調(diào)節(jié)的功能，且表現(xiàn)為速發(fā)效應(yīng)。趨化因子借助NK細(xì)胞參與抗腫瘤免疫的環(huán)節(jié)大致

4、為：吸引外周血NK細(xì)胞(該部位趨化因子濃度低)浸潤(rùn)腫瘤部位，促進(jìn)NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，這種結(jié)合使得大量趨化因子瞬間釋放出來(lái)，形成局部高濃度區(qū)域，不僅增強(qiáng)了NK的溶細(xì)胞作用，還可趨化大量NK細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞不斷進(jìn)入腫瘤局部；NK細(xì)胞分泌的多種無(wú)ELR的趨化因子破壞了腫瘤的微血管系統(tǒng)，導(dǎo)致其他效應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞毒分子滲出到腫瘤組織，引起腫瘤的出血壞死[8]。
　　 趨化因子CCL5也稱為RANTES，是受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和

5、分泌因子(regulate.upo.activatio.norma cel.expresse.an.secrete.factor.RANTES)，是趨化性細(xì)胞因子CC亞族成員(CCL5)。其來(lái)源廣泛，多數(shù)組織在炎性因子IL-1β或TNF-α的刺激下可釋放RANTES，RANTES由CD8+T細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血小板分泌。病毒感染可引起某些細(xì)胞RANTES的表達(dá)升高，如呼吸道合胞病毒感染可引起人鼻粘膜及腺樣上皮細(xì)胞RANTES的

6、表達(dá)升高；流感病毒感染可誘導(dǎo)人支氣管組織和鼻息肉的上皮細(xì)胞表達(dá)RANTES；某些腫瘤細(xì)胞在一定的條件下也可表達(dá)RANTES，如傷寒沙門氏菌感染或細(xì)胞因子可刺激HT-29、Caco-2細(xì)胞表達(dá)RANTES。RANTES對(duì)多種白細(xì)胞如T細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞具有趨化或刺激作用。其特異性受體屬7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR類)，包括CCR1、CCR3、CCR4和CCR5?，F(xiàn)認(rèn)為，RANTES對(duì)白細(xì)胞的趨化作

7、用依賴于RANTES與GAG的結(jié)合，GAG位于細(xì)胞外基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞表面[9]。因此RANTES的聚集能增強(qiáng)其趨化作用，可能是通過(guò)提高局部的RANTES濃度，使得吸引細(xì)胞所經(jīng)路徑形成RANTES的濃度梯度。近年來(lái)，RANTES基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的作用被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[10]，認(rèn)為該基因在腫瘤免疫治療方面具有潛力，逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。.基于以上研究根據(jù)，本研究構(gòu)建了攜帶ccl5基因以及氧依賴性蛋白降解結(jié)構(gòu)域基因odd的Ad5/F11

8、嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD，希望利用Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒更強(qiáng)的腫瘤感染能力與殺傷作用，在腫瘤內(nèi)部缺氧環(huán)境下特異性表達(dá)CCL5，提高攜帶ccl5基因的腺病毒的腫瘤殺傷能力。不僅如此，趨化因子CCL5也將趨化更多的淋巴細(xì)胞，尤其是T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞殺傷作用。并且我們將在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證趨化因子在腫瘤部位表達(dá)后對(duì)NK細(xì)胞的趨化能力，誘導(dǎo)更多的NK細(xì)胞靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，運(yùn)用機(jī)體自身的免疫反應(yīng)對(duì)腫瘤進(jìn)行消除。
　　

9、.Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD的構(gòu)建
　　 在前期實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)將Ad.fiber的knob和shaft替換為Adl.fiber的knob和shaft，構(gòu)建嵌合型Ad5/F11腺病毒骨架質(zhì)粒SG511。將攜帶ccl5基因及缺氧調(diào)控基因ODD的穿梭質(zhì)粒pPE3-F11B-CCL5-ODD與5型腺病毒骨架質(zhì)粒pSG502(CNHK500病毒的穿梭質(zhì)粒)通過(guò)Lipofectamin.200

10、0共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過(guò)三次病毒空斑純化，提取腺病毒DNA并應(yīng)用PCR進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為SG511-CCL5-ODD；同時(shí)重組出Ad5/F11嵌合型非增殖腺病毒AD5/11-CCL5-ODD與Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD。將重組出的病毒在293細(xì)胞中反復(fù)大量擴(kuò)增，通過(guò)氯化銫密度梯度離心法進(jìn)行純化，并用TCID50法測(cè)得重組腺病毒SG511-CCL5-ODD的

11、滴度達(dá)到2.79×1010pf./ml。
　　 .腺病毒SG511-CCL5-ODD治療肝癌的體外實(shí)驗(yàn)
　　 增殖實(shí)驗(yàn)表明SG511-CCL5-ODD能在肝癌細(xì)胞HepG2與Hep3B內(nèi)大量復(fù)制，在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增卻很弱；通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)確定SG511-CCL5-ODD能高效感染肝癌細(xì)胞HepG2與Hep3B并在缺氧條件下大量表達(dá)CCL5；將SG511-CCL5-ODD感染后的Hep3B細(xì)胞上清對(duì)NK92細(xì)胞進(jìn)行趨化

12、實(shí)驗(yàn)證實(shí)CCL5蛋白的活性，并證實(shí)CCL5對(duì)NK92細(xì)胞具有良好的趨化效應(yīng)。將增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD、非增殖型腺病毒AD5/11-CCL5-ODD感染細(xì)胞，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率并進(jìn)行病毒的肝癌殺傷作用比較。一系列體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SG511-CCL5-ODD對(duì)肝癌有很強(qiáng)的感染能力與腫瘤殺傷作用，安全性良好。
　　 .腺病毒SG511-CCL5-ODD治療肝癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 將BALB/c裸鼠皮下注

13、射SMMC-7721細(xì)胞懸液，建立肝癌動(dòng)物模型。將動(dòng)物隨機(jī)分為4組，分別瘤內(nèi)注射PBS、SG511-CCL5-ODD、AD5/11-CCL5-ODD、SG511治療。自接種之日起，定期測(cè)量腫瘤體積；4周后將腫瘤組織取出，固定后制成石蠟病理切片。將腫瘤組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察組織病變情況。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，攜帶ccl5基因的Ad5/F11嵌合型增殖腺病毒SG511-CCL5-ODD具有良好的體內(nèi)抑瘤作用，能抑制腫瘤的發(fā)生