腺病毒介導siMan2c1對腫瘤的殺傷作用.pdf

1、本實驗室于2000年報道克隆到了1個編碼新的人α-甘露糖苷酶MAN2C1的cDNA。本論文工作的目的是用RNAi技術抑制Man2c1基因在腫瘤細胞的表達，研究對腫瘤細胞惡性生物學行為的影響，并探討其治療腫瘤的可能性。首先用本實驗室已有的逆轉錄病毒載體pXSN-hU6+27，構建了pXSN-hU6+27-siMan2c1。包裝成逆轉錄病毒后，感染Man2c1基因高表達的人食道癌細胞株EC9706，并作了細胞克隆。用real-time RT

2、-PCR及用本人制備的抗MAN2C1單抗，檢測了克隆細胞的Man2c1基因表達，見與感染空載體病毒的細胞相比，克隆細胞的Man2c1基因表達明顯抑制。28個Man2c1因表達抑制的克隆細胞株中有15個在培養(yǎng)中不能存活，剩余的克隆株在培養(yǎng)中生長緩慢。用流式細胞儀對其中2個克隆株細胞作凋亡分析，凋亡率分別為7.30％(克隆1)和17.69／0(克隆2)，而野生型細胞和感染空載體病毒的細胞(M細胞)的凋亡率則分別為1.55％和1.44％，表明

3、Man2c1基因表達抑制促進了細胞凋亡。細胞周期分析克隆2細胞的G1期細胞占28.5％，S期細胞占43.9％和G2期細胞占27.6％。而野生型細胞和感染空載體病毒的細胞的G1期細胞比率為59.6％和58.2％，S期細胞為26.2％和27.09，0，G2期細胞為14.2％和14.7％。這顯示細胞的細胞周期受到了干擾。把細胞接種裸鼠皮下，腫瘤生長曲線顯示與野生型細胞和感染空載體病毒的細胞相比，Man2c1基因表達抑制的細胞的成瘤性生長受抑。

4、實驗第8周末的腫瘤平均重量為1.52±0.53g(克隆1)、1.47±0.62 g(克隆2)、3.033±0.65g(W細胞)和2.74±1.06g(M細胞)?？寺?或克隆2與W細胞或M細胞間的差別有統(tǒng)計學意義(t檢驗，p<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，所設計的siMan2c1能有效抑制Man2c1基因的表達，Man2c1基因表達抑制對食管癌細胞EC9706的惡性生物學行為有明顯的抑制作用。蛋白質的N-糖基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，Con

5、 A與Man2c1基因表達抑制的EC9706細胞的結合明顯低于對照細胞的現(xiàn)象提示，細胞蛋白質N-糖基化的變化可能在EC9706細胞惡性生物學行為減弱中起作用。 本論文工作隨即用腺病毒載體pDC316-EGFP-U6構建了重組腺病毒質粒，并包裝成腺病毒Ad5-siMan2c1。由于檢測不到Ad5-siMan2c1感染對EC9706細胞在培養(yǎng)中生長的影響(可能與Ad5-siMan2c1對EC9706細胞的感染率低有關)，我改用人鼻咽

6、癌細胞CNE-2L2做靶細胞，因為Ad5-siMan2c1對CNE-2L2細胞的感染率高，且Ad5-siMan2c1感染對CNE-2L2細胞在培養(yǎng)中的生長有明顯的抑制作用。把Ad5-siMan2c1射入接種野生型CNE-2L2細胞于裸鼠皮下所長的腫瘤，見與注射PBS或Ad5-EGFP相比，腫瘤的生長受抑(P<0.05)。由于在本實驗室以往對Man2c1基因表達抑制的CNE-2L2細胞與野生型CNE-2L2細胞所作的mRNA差異表達分析中

7、，見前者高表達的基因中以BCSC-1表達增強最顯著，在前者低表達的基因中以CD44表達減弱最顯著，而且本實驗室新近的研究確認BCSC-1基因異位表達或用siRNA抑制CD44表達，均使CNE-2L2細胞的惡性生物學行為減弱，故我也研究了腺病毒載體介導的對CNE-2L2細胞所長腫瘤的BCSC-1基因治療和siCD44治療。結果表明BCSC-1與siCD44均有治療作用。以上結果證明，Man2c1有可能成為某些腫瘤治療的靶基因，BCSC-1