腺病毒介導(dǎo)的CDglyTK雙自殺基因系統(tǒng)對瘢痕疙瘩治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、瘢痕疙瘩是臨床上常見的病理性瘢痕，也是美容、整形外科最棘手的難題之一。瘢痕疙瘩生長行為有類似腫瘤的特性，表現(xiàn)為超出原病損界限的持續(xù)性增生，并漸向周圍正常皮膚組織侵犯，單純手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率極高。目前國內(nèi)外的研究尚未能很好的揭示瘢痕疙瘩呈浸潤性過度生長的機(jī)制，因此臨床上尚無理想的治療方案，迫切需要研究出新的治療方法解決這一醫(yī)學(xué)難題，這已成為整形外科研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)問題。 自殺基因治療作為腫瘤基因治療的主要方法之一，已經(jīng)顯現(xiàn)出潛在的臨

2、床應(yīng)用前景和價值。目前已發(fā)現(xiàn)的自殺基因有多種，其中研究應(yīng)用最多的是單純皰疹病毒胸苷激酶基因（herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK）和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因（E.Coli-cytosine deaminase，CD）。TK基因編碼胸苷激酶，該酶可將核苷類似物（NA）代謝為二磷酸化物，后者在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下成為有毒性的三磷酸化物，阻止DNA復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而發(fā)揮抗腫瘤作用。CD基因編

3、碼胞嘧啶脫氨酶，編碼的胞嘧啶脫氨酶可將胞嘧啶代謝為尿嘧啶，亦可將無毒性的藥物前體5-Fc代謝成抗DNA合成的化療藥5-Fu，使腫瘤局部藥物濃度增加，達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的作用。雙自殺基因（CDglyTK基因）的產(chǎn)物同時具有兩種酶的活性，即CD和TK兩者的活性，可以產(chǎn)生互補(bǔ)的作用，可以大大提高其應(yīng)用價值，而不需考慮自殺基因的腫瘤細(xì)胞類型依賴性。CDglyTK雙自殺基因在腫瘤學(xué)的治療研究中已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但將其應(yīng)用于瘢痕疙瘩治療研究中在國

4、內(nèi)外尚未見報道。 本研究擬通過腺病毒載體將CDglyTK雙自殺基因在體外實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)入到瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，加入前藥后，觀察其對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的殺傷效應(yīng)和旁觀者效應(yīng)；觀察瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中促細(xì)胞凋亡基因Bax及Sphk2和促細(xì)胞增殖基因Bcl-2及Sphk1的mRNA和蛋白表達(dá)變化情況；觀察瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期改變情況；觀察瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡和形態(tài)改變情況；分別建立保留表皮的瘢痕疙瘩裸鼠移植模型及不保留表皮的瘢

5、痕疙瘩裸鼠移植模型并將兩者作對比，確定保留表皮瘢痕疙瘩裸鼠移植模型更有優(yōu)越性，并將其應(yīng)用；觀察腺病毒介導(dǎo)的CDglyTK雙自殺基因系統(tǒng)對裸鼠皮下移植的瘢痕疙瘩組織塊的治療作用；觀察組織塊的形態(tài)學(xué)變化及組織病理改變、凋亡改變及促細(xì)胞凋亡基因Bax及Sphk2和促細(xì)胞增殖基因Bcl-2及Sphk1的蛋白表達(dá)變化情況，以探討腺病毒介導(dǎo)的CDglyTK雙自殺基因?qū)︸：鄹泶竦闹委熥饔眉捌渥饔脵C(jī)制。 方法: 1.利用改良AdEasy

6、系統(tǒng)構(gòu)建并制備高滴度純化的重組CDglyTK雙自殺基因腺病毒液：將CDglyTK雙自殺基因從PWZLneoCDglyTK質(zhì)粒上雙酶切切下通過中間載體pcDNA3轉(zhuǎn)移到穿梭質(zhì)粒track-CMV中，將track-CMV-CDglyTK通過PmeⅠ線性化后在5183菌中與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1重組，得到Ad-CDglyTK質(zhì)粒；將Ad-CDglyTK質(zhì)粒用PacⅠ酶切后轉(zhuǎn)化到293細(xì)胞中，包裝得到Ad-CDglyTK腺病毒； 2

7、.組織塊法培養(yǎng)瘢痕疙瘩以成纖維細(xì)胞；取第4-8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，分別以25％感染，50％感染，75％感染及100％感染的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞加入前藥后MTT法觀察腺病毒介導(dǎo)的CDglyTK雙自殺基因系統(tǒng)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的殺傷效應(yīng)和旁觀者效應(yīng)； 3.分別培養(yǎng)轉(zhuǎn)染CDglyTK基因（MOI=20）和未轉(zhuǎn)染CDglyTK基因的成纖維細(xì)胞，共4組，分為a組（空白對照組）、b組（未轉(zhuǎn)染CDglyTK基因加前藥組）、c組（轉(zhuǎn)染CDglyTK

8、基因未加前藥組）及d組（轉(zhuǎn)染CDglyTK基因加前藥組），利用HE染色檢測細(xì)胞的形態(tài)變化；利用TUNEL凋亡檢測法檢測成纖維細(xì)胞的凋亡狀態(tài)；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化情況；利用免疫組化、Real-Time PCR及Western Blot檢測Bcl-2/Bax及Sphk1/Sphk2基因的變化情況； 4.分別使用保留表皮的瘢痕疙瘩組織塊和不保留表皮的瘢痕疙瘩組織塊制作瘢痕疙瘩裸鼠移植模型，根據(jù)瘢痕疙瘩大體形態(tài)及組織學(xué)觀察對模

9、型作評價； 5.將裸鼠移植模型分為4組，分別為a組（瘢痕內(nèi)注射生理鹽水）、b組（瘢痕內(nèi)注射生理鹽水+腹腔注射5-Fc和GCV）、c組（瘢痕內(nèi)注射CDglyTK雙自殺基因腺病毒）及d組（瘢痕內(nèi)注射CDglyTK雙自殺基因腺病毒+腹腔注射5-Fc和GCV），觀察瘢痕疙瘩體積塊的變化情況：利用TUNEL凋亡檢測法檢測瘢痕疙瘩組織塊成纖維細(xì)胞凋亡情況；利用免疫組化檢測瘢痕疙瘩組織塊中治療前后Bcl-2/Bax及Sphk1/Sphk2基因

10、的表達(dá)變化情況。 結(jié)果: 1.利用改良AdEasy系統(tǒng)成功構(gòu)建CDglyTK雙自殺基因腺病毒質(zhì)粒，PacⅠ酶切后產(chǎn)生2條DNA片段，分別為30kb和4.5kb；BstxⅠ酶切重組成功的質(zhì)粒后，相對腺病毒骨架質(zhì)?？梢娖渲?.24kb條帶消失；PCR鑒定能擴(kuò)增出特異性的CD和TK基因的目的條帶；經(jīng)293細(xì)胞包裝得到腺病毒，透射電鏡下證實(shí)腺病毒顆粒存在。 2.CDglyTK雙自殺基因腺病毒對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的最佳感染

11、復(fù)數(shù)（MOI）為20，在MOI=20時感染效率達(dá)到>95％；在前藥作用下，當(dāng)感染腺病毒的成纖維細(xì)胞的比例達(dá)到25％時可產(chǎn)生部分殺傷效應(yīng)，當(dāng)感染腺病毒的成纖維細(xì)胞的比例達(dá)到50％時能產(chǎn)生完全殺傷作用，證實(shí)腺病毒介導(dǎo)的CDglyTK雙自殺基因系統(tǒng)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺傷效應(yīng)和旁觀者效應(yīng)； 3.HE染色發(fā)現(xiàn)d組成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯減少，同時細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞膨脹呈球形改變，細(xì)胞膜及細(xì)胞核有空泡樣改變，而在對照組中未

12、出現(xiàn)異常變化；TUNEL凋亡檢測發(fā)現(xiàn)d組中成纖維細(xì)胞幾乎都出現(xiàn)凋亡改變，與a，b及c組有明顯差別；流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)d組中大量的成纖維細(xì)胞被阻滯于G1期，與a，b及c組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Real-Time PCR及WesternBlot定量檢測發(fā)現(xiàn)d組成纖維細(xì)胞中Bax表達(dá)增高及Bcl-2表達(dá)降低，Sphk1表達(dá)降低及Sphk2表達(dá)增高，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Bcl-2/Bax及Sphk1/Sphk2基因表達(dá)定位未出現(xiàn)明顯

13、異常； 4.分別采用保留表皮組織塊和不保留表皮組織塊建立瘢痕疙瘩裸鼠移植模型，術(shù)后第2周至第8周瘢痕疙瘩組織塊體積變化率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），保留表皮組瘢痕疙瘩裸鼠移植模型組織塊維持時間較去表皮組更長；移植后瘢痕疙瘩組織內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且隨時間延長增加，膠原纖維結(jié)構(gòu)隨時間延長逐漸減少； 5.形態(tài)學(xué)觀察可見d組裸鼠瘢痕疙瘩組織塊體積在治療后隨著治療時間的延長逐漸縮小，治療14天后與治療前及同時間點(diǎn)

14、a，b及c組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；a，b，c三組組織塊體積最大值分別出現(xiàn)在用藥后21，14，7天；HE染色可見d組瘢痕疙瘩組織正常形態(tài)被破壞，膠原結(jié)構(gòu)被破壞，大量的細(xì)胞浸潤，且將膠原分割包繞，膠原組織結(jié)構(gòu)松散，僅殘留部分膠原組織，可見較多血管形成；TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)各組均有成纖維細(xì)胞的凋亡，但在d組中出現(xiàn)大量的成纖維細(xì)胞凋亡，較對照組明顯增加；發(fā)現(xiàn)Bcl-2及Sphk1基因的表達(dá)在d組減弱，明顯低于a組，b組和c組

15、； Bax及Sphk2基因的表達(dá)在d組明顯增強(qiáng)。 結(jié)論: 1.利用改良AdEasy系統(tǒng)能夠高效率的成功構(gòu)建CDglyTK雙自殺基因腺病毒； 2.CDglyTK雙自殺基因腺病毒能夠有效的感染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞并在成纖維細(xì)胞中成功表達(dá)雙自殺基因，能夠?qū)︸：鄹泶癯衫w維細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的殺傷效應(yīng)和旁觀者效應(yīng)； 3.腺病毒介導(dǎo)的CDglyTK雙自殺基因系統(tǒng)通過誘導(dǎo)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞出現(xiàn)凋亡實(shí)現(xiàn)其對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的殺

16、傷作用；Bcl-2和Sphk1表達(dá)降低，Bax和Sphk2表達(dá)增高是導(dǎo)致成纖維細(xì)胞凋亡的重要因素之一；成纖維細(xì)胞被阻滯于G1期是腺病毒介導(dǎo)的CDglyTK雙自殺基因系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一個重要機(jī)制； 4.保留表皮的瘢痕疙瘩裸鼠移植模型優(yōu)于傳統(tǒng)的瘢痕疙瘩裸鼠移植模型，組織塊維持時間更長； 5.在瘢痕疙瘩裸鼠移植模型中腺病毒介導(dǎo)的CDglyTK雙自殺基因系統(tǒng)也有較強(qiáng)的治療作用；成纖維細(xì)胞的凋亡是其主要的表現(xiàn)形式；Bcl-2和S