結(jié)核桿菌抗原誘導(dǎo)活化的人γδT細(xì)胞L-選擇素的表達(dá)規(guī)律及調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的(1)探討L一選擇素(CD62L)在結(jié)核桿菌抗原(Mtb-Ag)誘導(dǎo)人~8T細(xì)胞表達(dá)的動(dòng)力學(xué)特征；(2)觀察不同細(xì)胞因子對(duì)活化人~8T細(xì)胞表達(dá)L．選擇素的調(diào)節(jié)作用；(3)應(yīng)用信號(hào)分子阻斷劑初步探討PKC，P13K，MAPK等信號(hào)途徑在人78T細(xì)胞活化過(guò)程中對(duì)L．選擇素表達(dá)的調(diào)控作用。 方法(1)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞分別用Mtb-Ag和CD3單抗(CD3mAb)刺激并加IL-2培養(yǎng)擴(kuò)增，分別獲得Mtb-Ag激活的T細(xì)胞(Mt

2、bAT)(78T細(xì)胞為主)和CD3mAb激活的T細(xì)胞(CD3AT)(αβT細(xì)胞為主)。(2)取新鮮PBMC和刺激后培養(yǎng)3～21天的~8T細(xì)胞和αβT細(xì)胞，用多色熒光抗體標(biāo)記，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)~8T細(xì)胞表面L一選擇素的表達(dá)，并與αβT細(xì)胞作比較。(3)Mtb-Ag初次與再次刺激人~8T細(xì)胞分別培養(yǎng)7天，在培養(yǎng)同時(shí)分別按組加入IFN-7、anti-IFN-y、IL-12、anti-IL-12，并與培養(yǎng)的不同時(shí)間分別收集細(xì)胞，檢測(cè)L．選擇素

3、表達(dá)情況。(4)培養(yǎng)6d~8d的MtbAT分別加入PMA、Ionomycin(IMN)、PMA+IMN培養(yǎng)3h、6h、12h、24h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分別檢測(cè)L．選擇素的表達(dá)率。(5)培養(yǎng)8天的γ6T細(xì)胞分別加入Mtb—Ag、Rotterin+Mtb—Ag、PMA、Rotterin+PMA刺激4h，收集細(xì)胞并檢測(cè)L一選擇素表達(dá)。(6)MtbAT或CD3AT預(yù)先用LY294002(P13K途徑抑制劑)、SB203580(p38途

4、徑抑制劑)、PD980590(MEK抑制劑)分別處理20min，然后用Mtb-Ag或CD3mAb再刺激3h，檢測(cè)MtbAT或CD3AT細(xì)胞表面L．選擇素的表達(dá)情況。 結(jié)果(1)新鮮PBMC中76T細(xì)胞L一選擇素的表達(dá)率為(43．9±6．7)％，αβT細(xì)胞L-選擇素的表達(dá)率為(76．6±7．9)％，有顯著差異(P

5、，用CD3mAb刺激和IL-2共同培養(yǎng)9天后產(chǎn)生的CD3AT中αβT細(xì)胞比例>90％。(3)培養(yǎng)3天時(shí)yST細(xì)胞表面L．選擇素的表達(dá)與新鮮PBMC無(wú)差別(p>0．05)。用MtbAg或CD3Ab激活后培養(yǎng)第6d時(shí)L一選擇素在75T細(xì)胞的表達(dá)(90．7％)和在αβT細(xì)胞表達(dá)(87．2％)均達(dá)到高峰；以后L一選擇素表達(dá)逐漸下降，15d-21d7bT細(xì)胞L-選擇素的表達(dá)在低水平(16．2％-10．6％)維持，僅αβT細(xì)胞表面的L_選擇素表達(dá)(

6、23．6-17．5％)亦在低水平維持。(4)加入IL一12或IL一12與IFN-7共同培養(yǎng)時(shí)，L一選擇素在76T細(xì)胞初次刺激與再次刺激時(shí)的表達(dá)均較對(duì)照組高(P<0·05)；但僅加入IFN-7時(shí)，L一選擇素的表達(dá)率與陰性對(duì)照組相比無(wú)差別(P>0·05)。(5)PMA刺激γ6T細(xì)胞3h、6h時(shí)L一選擇素表達(dá)下調(diào)，表達(dá)率分別為42·3％、38·7％；PMA+IMN刺激y6T細(xì)胞3h、6h時(shí)L一選擇素表達(dá)也下調(diào)，表達(dá)率分別為52·l％、39．3

7、％：而在12h時(shí)PMA+IMN刺激的Y6T細(xì)胞L一選擇素表達(dá)上升為52·9％，PMA刺激組L一選擇素表達(dá)則繼續(xù)下調(diào)為23．5％；24h時(shí)PMA+IMN刺激組L一選擇素又下降為35．3％，PMA刺激組L一選擇素表達(dá)上調(diào)為53．2％：IMN刺激組L一選擇素表達(dá)在12h后才表現(xiàn)為下調(diào)其在y6T細(xì)胞的表達(dá)。(6)PKC特異性刺激劑PMA可使L一選擇素的表達(dá)降低為31．8％，加入PKCθ特異性抑制劑Rotterin后L一選擇素表達(dá)為63．1％，但

8、沒(méi)有達(dá)到刺激前水平70．0％，表明Rotterin可部分抑制Mtb-Ag刺激引起的L一選擇素表達(dá)的下調(diào)，另外Rotterin可部分阻止PMA下調(diào)L一選擇素47·9％，表明PKCO參與L一選擇素的調(diào)控。(7)Mtb-Ag再刺激MtbAT誘導(dǎo)75T細(xì)胞L-選擇素表達(dá)下調(diào)69．5％，預(yù)先加入LY294002或PD980590，則L．選擇素表達(dá)率分別為83．1％和75．7％；而加入SB203580未見(jiàn)明顯影響。在CD3^T細(xì)胞中，預(yù)先加入LY2

9、94002、PD980590或SB203580則均可抑制L．選擇素的下調(diào)。 結(jié)論(1)外周循環(huán)血液中新鮮分離的PBMC中TbT細(xì)胞L．選擇素表達(dá)率低于αpT細(xì)胞。(2)78T細(xì)胞活化后L一選擇素表達(dá)呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢(shì)，最后穩(wěn)定在低水平。(3)IL一12在76T細(xì)胞活化時(shí)維持L．選擇素的表達(dá)。(4)78T細(xì)胞活化時(shí)L-選擇素表達(dá)下調(diào)通過(guò)PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。(5)7bT細(xì)胞和αpT細(xì)胞活化時(shí)L一選擇素表達(dá)調(diào)控與P13K、Ras