長時程心室顫動犬病理生理變化及縫隙連接蛋白調(diào)節(jié)劑ZP123的干預研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 長時程心室顫動犬生理和生化指標的變化及復蘇后心功能不全與基質(zhì)金屬蛋白酶-9及其抑制物-1表達的研究
　　目的:
　　1.通過對長時程心室顫動犬體內(nèi)生理和生化過程的變化進行研究，試圖從病理生理方面揭示室顫發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在規(guī)律;
　　2.通過心室顫動復蘇動物模型研究TIMP-1與MMP-9的表達變化;
　　3.研究TIMP-1與MMP-9的表達變化對心室顫動復蘇后心功能的

2、影響。
　　方法:
　　1.心室顫動動物模型的構建和分組
　　成年犬30只，(體重13.5-18.5kg)，隨機分為3組，假手術組(n=10)，8min室顫組(n=10)和12min室顫組(n=10)。以3％戊巴比妥納30mg/kg腹腔內(nèi)麻醉成功后，仰臥位固定，肢體去毛后粘貼三導聯(lián)電極，外聯(lián)多導電生理儀以取得體表心電圖信號。
　　2.各組動物的生理生化指標、心功能及心肌TIMP-1和MMP-9濃度的監(jiān)測
　

3、　2.1 血流動力學參數(shù)
　　連續(xù)記錄室顫前、室顫發(fā)生后12分鐘內(nèi)及復蘇后犬主動脈收縮壓、主動脈舒張壓、主動脈壓力和右房壓。冠脈灌注壓為AODP與RAP的差值，室顫后復蘇前為AOP與RAP的差值。
　　2.2 血液生化、血氣分析及凝血/抗凝系列指標
　　在心室顫動前，室顫后每隔1min取動靜脈血，動脈血取得后立即行血氣分析測定，測定其動脈血氧分壓、二氧化碳分壓、動脈血pH值、乳酸濃度等指標;靜脈血取得后應用血液生化儀測

4、定肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白、血清鉀離子、鈉離子、氯離子、鈣離子濃度等血液生化指標，凝血/抗凝系列指標則包括纖維蛋白原（Fibrinogen，F(xiàn)b）、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ))、和D-二聚體(D-Dimer)濃度。
　　2.3 超聲心動圖測量
　　動物致顫前和恢復自主循環(huán)1小時后行胸二維超聲分別測量致顫前，ROSC后左房內(nèi)徑，左室舒張期內(nèi)徑和左室射血分數(shù)。
　　2.4 心肌TIMP-

5、1和MMP-9測定
　　室顫維持8min或12min后，進行心肺復蘇和電除顫。免疫組化和Western Blot技術檢測假手術組、心室顫動8min組、12min組復蘇成功犬心肌TIMP-1和MMP-9的水平。
　　3.統(tǒng)計學分析
　　所用數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)值變量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用小樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用One-WayANOVA方差分析，以P＜0.05

6、為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　實驗過程中，30只犬中。26只一次誘發(fā)心室顫動成功，4只二次誘發(fā)心室顫動成功，均持續(xù)12min。復蘇后8min室顫組和12min室顫組分別有7只和5只動物恢復自主循環(huán)。
　　1.各組動物基礎狀態(tài)各項指標比較
　　實驗前各組動物的體重，心率，左心房內(nèi)徑、左心室內(nèi)徑、左室射血分數(shù)以及血流動力學、血氣分析、凝血指標和血生化指標均無顯著性差異。
　　2.室顫后各項生理生化指標<

7、br>　　2.1 血流動力學參數(shù)。
　　2.2 血液生化指標。
　　2.3 血氣分析指標。
　　2.4 凝血/抗凝系列指標
　　3.動物恢復自主循環(huán)后血流動力學和心功能情況。
　　4.MMP-9和TIMP-1與心功能的關系
　　TIMP-1的水平與LAD負相關（r=-0.83; P＜0.05），與LVDd呈負相關(r=-0.96，P＜0.05)，與LVEF呈正相關（r=0.85，P＜0.05），即隨著

8、TIMP-1的逐漸減少LAD，LVDd逐漸增大，LVEF逐漸降低。
　　結論:
　　1.長時程心室顫動的病理過程呈現(xiàn)階段性變化，漸次出現(xiàn)血流動力學障礙，酸堿平衡紊亂，凝血和繼發(fā)性纖溶亢進;
　　2.室顫復蘇后存在TIMP-1和MMP-9的表達失衡，此失衡可能與心功能的降低相關。
　　第二部分 縫隙連接蛋白調(diào)節(jié)劑ZP123對犬不同時程心室顫動的作用
　　目的:
　　1.根據(jù)前述心室顫動的臨床和生化階段，

9、評估Cx43在心室顫動不同階段表達與分布的變化;
　　2.縫隙連接蛋白調(diào)節(jié)劑ZP123在室顫不同階段對縫隙連接蛋白Cx43的影響;
　　3.觀察ZP123對不同時程室顫除顫能量及除顫成功率的影響;
　　4.評價ZP123對不同時程室顫復蘇率的影響。
　　方法:
　　1.實驗動物
　　隨機選取健康成年家犬60只，雌雄不限，體重13.5-18.5kg，隨機分為五組。
　　2.室顫模型的構建
　

10、　3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)耳緣靜脈靜注麻醉，氣管插管，連接呼吸機，在SIMV模式下調(diào)整呼吸機參數(shù)為:潮氣量10-15ml/kg體重，呼吸頻率16-20次/分，吸入氧濃度(FiO250％-80％)，吸氣與呼氣時間比為1∶1.5-2.0，呼氣末正壓為5cmH2O(0.49Kpa)。
　　將體外電刺激器火線端與零線端的導電針頭分別插入心前區(qū)左上方與右下方的皮下，以80V持續(xù)刺激5S可以成功的誘發(fā)持續(xù)室顫。
　　3.心肺復蘇

11、
　　室顫模型成功建立后，即撤除呼吸機，待室顫持續(xù)8min和12min后，立即開始胸外心臟按壓，同時接氣囊，按壓通氣比為30∶2，5個復蘇周期即2分鐘后，進行心律評估，仍為室顫的給予雙向非同步電除顫，根據(jù)預實驗結果將首次除顫能量為70J，若未能終止，則將除顫能量依次遞增為100J、150J，以后的能量均為150J。
　　4.血流動力學指標及心電圖參數(shù)
　　記錄室顫前及心肺復蘇后的各項血流動力學指標:主動脈收縮壓、主動脈

12、舒張壓、主動脈平均壓;右心房收縮壓、右心房舒張壓、右心房平均壓，冠狀動脈灌注壓。
　　5.平均除顫能量、除顫成功率和自主循環(huán)恢復率
　　記錄室顫心肺復蘇過程中各組動物的平均除顫能量（各組動物復蘇成功后總除顫能量/復蘇成功動物只數(shù)）、各除顫能量級除顫成功率(70J、100J、150J)和自主循環(huán)恢復率，并加以分析比較。
　　6.免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡
　　存活時間達到一小時的動物用10％氯化鉀處死，迅速開胸，沿

13、左心室長軸留取0.5cm3大小的左心室游離壁心肌組織數(shù)塊，一部分用4％多聚甲醛固定用于免疫熒光分析，另一部分放入液氮中速凍然后轉存至-80℃冰箱凍存，用于Western-Blot分析。
　　7.Western-Blot分析
　　提取蛋白，上樣，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。待電泳結束后，把目的蛋白轉至PVDF膜上。
　　結果:
　　1.犬的一般狀況
　　各組動物基礎狀態(tài)無統(tǒng)計學差異;8min藥物組有8只動物達

14、自主循環(huán)恢復并存活1小時，8min常規(guī)復蘇組有6只動物達自主循環(huán)恢復并存活1小時。12min藥物組有5只動物達自主循環(huán)恢復并存活1小時，12min常規(guī)復蘇組有4只動物達自主循環(huán)恢復并存活1小時。
　　2.各組動物達到ROSC后血流動力學參數(shù)以及心電圖參數(shù)比較
　　室顫模型建立成功后，于8min和12min后進行心肺復蘇和非同步電除顫，記錄分析各組動物達到ROSC后血流動力學參數(shù)以及心電圖參數(shù)，結果顯示:各組動物達到ROSC后

15、的血流動力學參數(shù)總體之間無差異(P＞0.05)。
　　3.各組動物平均除顫能量、除顫成功率和自主循環(huán)恢復率
　　8min組:藥物組平均除顫能量明顯低于常規(guī)復蘇組(427.2±126.4J vs.560.7±128.9J，P=0.045)，各能量級除顫成功率均明顯高于常規(guī)復蘇組。
　　12min組:藥物組動物的除顫能量明顯低于12min常規(guī)復蘇組。
　　4.免疫熒光結果
　　假手術組Cx43熒光信號強，形態(tài)清

16、晰，分布均勻，排列有序;常規(guī)復蘇組Cx43熒光信號弱，形態(tài)模糊，排列紊亂，呈現(xiàn)不均一分布;藥物組Cx43的熒光信號較強，形態(tài)相對清晰，不均一分布的程度較常規(guī)復蘇組減輕。
　　12min常規(guī)復蘇組Cx43熒光信號的面積百分比以及積分光密度值明顯低于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義;12min常規(guī)復蘇組的Cx43熒光信號的面積百分比以及積分光密度值明顯低于12min藥物組，差異有統(tǒng)計學意義。12min藥物組Cx43熒光信號的面積百分比以及積

17、分光密度值明顯低于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　5.Western-Blot結果:
　　圖像定量分析顯示，8min常規(guī)復蘇組Cx43表達水平（0.75±0.07）較假手術組（1.07±0.04）及8min藥物組Cx43表達水平（0.95±0.06）明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);12min常規(guī)復蘇組Cx43表達水平（0.58±0.05）較假手術組（1.07±0.04）及12min藥物組Cx43表達水平（0.7