萊克多巴胺單克隆抗體的制備及其CiELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、萊克多巴胺(Ractopamine,RAC)屬β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑,臨床上主要用于治療支氣管哮喘、支氣管痙攣和產(chǎn)科疾病。萊克多巴胺與克倫特羅一樣,能改變養(yǎng)分的代謝途徑,促進(jìn)動(dòng)物體蛋白質(zhì)沉積,同時(shí)抑制脂肪的合成和積累,最終改變胴體品質(zhì),加快動(dòng)物的生長速度。然而,高劑量的RAC對(duì)動(dòng)物有一定的毒副作用,人體食用了高RAC殘留的動(dòng)物性食品后,也會(huì)產(chǎn)生毒副作用。歐盟早已明確禁止在食用性動(dòng)物中使用包括萊克多巴胺在內(nèi)的所有β-腎上腺素興奮劑類藥物

2、,美國雖允許使用,但對(duì)用量和操作程序有嚴(yán)格規(guī)定。中國也明文禁止使用,但生豬生產(chǎn)中非法使用RAC的現(xiàn)象仍很嚴(yán)重。
　　 國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種檢測(cè)RAC殘留的理化檢測(cè)方法,如HPLC和GC-MS等,這些方法雖然準(zhǔn)確、敏感、有效,但均需要昂貴的儀器、專業(yè)的操作技能和復(fù)雜的樣品前處理程序,且費(fèi)時(shí),不適合用于大批量樣品的檢測(cè)。ELISA方法是目前檢測(cè)該藥物最普遍的方法,具有快速、靈敏、操作簡單和一次檢測(cè)樣品量大的特點(diǎn),且樣品前處理過程相對(duì)

3、簡單,檢測(cè)結(jié)果與HPLC、GC-MS檢測(cè)有較高一致性,因而常用作篩查方法。
　　 本研究以單克隆抗體和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)為基礎(chǔ),研制出針對(duì)RAC的單克隆抗體,并初步建立了檢測(cè)RAC的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(CiELISA)。添加回收試驗(yàn)證明,建立的檢測(cè)RAC殘留的CiELISA可以用于樣品殘留的檢測(cè)。
　　 1.RAC人工抗原的合成與鑒定。分別采用多元酸酐與混合酸酐聯(lián)用法和碳二亞胺法將RAC與載體蛋白偶聯(lián),制備人工抗原

4、RAC-BSA、RAC-HAS,通過紫外掃描和免疫學(xué)方法初步鑒定偶聯(lián)成功。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn),選擇RAC-BSA作為免疫原,RAC-HAS為包被原。
　　 2.RAC單抗的制備。用合成的RAC-BSA常規(guī)免疫BALB/c小鼠,五免后血清效價(jià)達(dá)1:32,000以上。利用單克隆抗體技術(shù)和酶免疫學(xué)檢測(cè)方法篩選獲得1株可持續(xù)分泌針對(duì)萊克多巴胺抗體的雜交瘤細(xì)胞株5D7。體內(nèi)誘生法制備了抗RAC的腹水,蛋白濃度為21.3mg/mL,腹水效價(jià)為1:

5、128,000。
　　 3.ELISA檢測(cè)方法的建立。用5D7雜交瘤細(xì)胞株制備的抗RAC腹水制作RAC標(biāo)準(zhǔn)競爭曲線,線性方程為Y=-0.4095x+0.7134(R2=0.991),IC50為4.75ng/mL,LOD低于0.5ng/mL,LOQ為0.92ng/mL。特異性實(shí)驗(yàn)表明,該單抗對(duì)RAC的抑制率為100％,對(duì)其它一些B.興奮劑的抑制率均小于0.1％。
　　 4.添加回收實(shí)驗(yàn)。將建立的CiELISA檢測(cè)方法應(yīng)用于