hNIS轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細胞介導放射性碘治療的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 結(jié)腸癌起病隱匿，早期常無明顯的臨床表現(xiàn)，病情發(fā)展較慢，出現(xiàn)明顯的癥狀時大多已到了中晚期，死亡率僅次于肺癌和肝癌，占我國惡性腫瘤第三位[1]。進展期結(jié)腸癌的治療效果多年來未見顯著提高。一方面由于其生物學特性復雜且惡性程度高;另一方面在于化療的多藥耐藥性令其預后不理想。
　　 然而臨床上分化型甲狀腺癌患者口服放射性碘(131I)后，能顯著延長生存率，是因為131I可被甲狀腺癌細胞特異性地獲取，利用131I釋放的

2、β射線達到治療目的。131I治療甲狀腺癌的基礎(chǔ)是由于甲狀腺細胞具有鈉/碘轉(zhuǎn)運體(sodium/iodide symportor, NIS)，它能高度的攝碘和濃聚碘。131I治療甲狀腺癌是真正意義上的靶向治療。
　　 近年來，隨著人類對各類腫瘤發(fā)病機制的認識不斷深入，分子生物學技術(shù)的發(fā)展，尤其是DNA重組和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的逐步成熟，NIS作為人類腫瘤的一種治療基因，擴展131I在非甲狀腺癌中的治療是NIS最具前景的研究領(lǐng)域。我們設(shè)想

3、將轉(zhuǎn)基因技術(shù)與放射性核素治療相結(jié)合，將hNIS基因轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌SW480細胞中，使原本不攝碘的SW480細胞獲得攝取碘的能力，然后利用131I的輻射生物效應，達到殺傷腫瘤細胞。即研究131I對結(jié)腸癌治療的可能性。
　　 方法:
　　 1.對構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS進行測序和BamHI/EcoR(I)酶切鑒定;進而轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進行擴增、提取。
　　 2.培養(yǎng)SW480細胞，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染hN

4、IS基因至SW480細胞后行RT-PCR和WB檢測轉(zhuǎn)染細胞hNIS mRNA和蛋白的表達情況。
　　 3.轉(zhuǎn)染的SW480細胞經(jīng)抗生素G418篩選獲得穩(wěn)定表達hNIS基因的細胞系(hNIS-SW480)
　　 4.行體外攝131I試驗及過氯酸鹽抑制實驗。
　　 5.AnnexinV-FITC/PI雙染行流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.重組質(zhì)粒（pcDNA3.1+-hNIS）測

5、序結(jié)果顯示整個核苷酸序列包括起始密碼子ATG到終止密碼子TGA的643個氨基酸，基因大小和方向完全正確。基因序列和NCBI序列CDS區(qū)序列相匹配。BamH(I)/EcoR(I)酶切并電泳鑒定酶切產(chǎn)物結(jié)果顯示重組質(zhì)粒(pcDNA3.1+-hNIS)在1944bp和5405bp左右有兩條清晰電泳條帶，與理論計算結(jié)果相符，證實本次構(gòu)建質(zhì)粒為重組質(zhì)粒（pcDNA3.1+-hNIS）。
　　 2.擴增提取質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳可見在7000b

6、p左右有清晰條帶，BamH I/EcoRI酶切電泳亦在1944bp和5405bp左右見清晰條帶，說明提取質(zhì)粒成功。
　　 3.脂質(zhì)體法將hNIS基因轉(zhuǎn)染至SW480細胞后，行RT-PCR和WB電泳結(jié)果顯示可見hNIS mRNA和蛋白的表達，而在對照組和空白質(zhì)粒組均未檢測到hNISmRNA及蛋白的表達。說明本實驗轉(zhuǎn)染SW480細胞成功。
　　 4.轉(zhuǎn)染組SW480細胞經(jīng)抗生素G418篩選后獲得穩(wěn)定表達細胞系(hNIS-SW

7、480)，它對G418的最終耐受濃度為300μg/ml，空白對照組與空白質(zhì)粒組對G418沒有抗性而死亡。
　　 5.測15μci131I孵育(hNIS-SW480)細胞系各時段(4、8、16、24、36、48h)攝131I能力:結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組細胞4h-24h攝131I碘曲線呈上升趨勢，24小時攝碘達高峰，24h-48h攝131I碘曲線呈緩慢遞減。而空白對照組與空白質(zhì)粒組各時段的攝131I碘曲線未見顯著變化。15μci131I孵育

8、24小時后，轉(zhuǎn)染組比空白對照組與空白質(zhì)粒組的攝131I能力均增高約8倍(P＜0.05)。
　　 6.過氯酸鹽抑制試驗結(jié)果顯示:沒加入NaCLO4的hNIS-SW480細胞系具有較高攝131I能力，加入NaClO4后(hNIS-SW480)細胞攝131I能力明顯受到抑制，攝131I能力減低約10倍(P＜0.05)，證明轉(zhuǎn)染組的攝碘功能為hNIS基因功能。
　　 7.24小時100μci131I殺傷下hNIS-SW480細胞

9、凋亡檢測:使用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細胞16小時早期凋亡顯著，24小時晚期凋亡顯著升高。轉(zhuǎn)染組凋亡指數(shù)高于空白對照組與空白質(zhì)粒組。說明131I對轉(zhuǎn)染hNIS-SW480細胞系具有顯著殺傷效果。
　　 結(jié)論:
　　 1.pcDNA3.1+-hNIS重組質(zhì)粒擴增、提取成功。
　　 2.重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細胞并表達hNIS蛋白。<