細絲蛋白A對人結腸癌SW480細胞株體外侵襲能力影響的研究.pdf

1、背景：結直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是發(fā)生于結腸部位常見的消化道惡性腫瘤,CRC的病死率居癌癥病死率的第2位,在全世界范圍居第4位,好發(fā)于直腸及直腸與乙狀結腸交界處,約占65％,發(fā)病大多在40歲以后,男女比例為2～3:1。以40～50歲年齡組發(fā)病率最高。各地資料顯示,隨著人們生活水平的提高,飲食結構的改變,其發(fā)病率正呈逐年上升趨勢[1]。且療效并不樂觀,近年來的結直腸癌5年生存率徘徊在50％-60％[2];

2、此外,結腸癌的復發(fā)與遠處轉移是結腸癌患者愈后不良的主要原因。因此,急待進行與結腸癌相關的基礎研究為臨床診斷及治療提供指導。既往研究表明,細絲蛋白A(FLNa)與乳腺癌、前列腺癌、惡性膠質瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[3],近年來,隨著對FLNa研究的不斷深入,認為FLNa在結直腸癌的形成和發(fā)展中具有重要作用,有望成為新的檢測結直腸腺癌發(fā)生、形成、復發(fā)、轉移的分子標志物,而且對其抑癌機制的深入研究還可為臨床建立個體化、靶向化治療結直腸癌提供理論依

3、據。
　　 我們在前期研究中,對60例標本采用免疫組織化學SP法,以人子宮組織著色作為陽性對照,以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗進行染色作為陰性對照,結果證明結腸癌組織的FLNa蛋白表達低于正常組,說明FLNa蛋白可抑制結直腸腺癌的發(fā)生,在病理狀態(tài)下呈低表達,并且FLNa蛋白其表達水平與結直腸腫瘤的侵襲力呈負相關,對腫瘤的侵襲及轉移具有明顯阻遏作用,因此有望成為結直腸腫瘤診斷,治療、預后的新指標[4]。此外,我們在前期研究中,通

4、過對60例結腸腺癌患者手術切除的結直腸腺癌組織和正常結直腸組織進行RT-PCR法和Westem印跡法檢測,發(fā)現(xiàn)MMP-9在結直腸腺癌組織中的陽性表達率高于正常結直腸組織,并且在癌組織中的表達水平與FLNa蛋白表達水平呈負相關,其表達與腫瘤的TNM分期,肝轉移,淋巴結轉移和腸壁浸潤深度也具有相關性[5]。本組實驗將通過細胞轉染、RT-PCR和Western blot檢測、MTT試驗、劃痕實驗、Transwell小室和Matrigel侵襲模

5、型進一步探討FLNa對人結腸癌細胞SW480的增殖和移行的影響,并初步探討其抑癌機制,以期尋找診斷及治療結直腸癌的新方法。
　　 目的:
　　 研究細絲蛋白A(FLNa)對人結腸癌SW480細胞侵襲和轉移行為的影響,并初步探討其抑癌的機制。
　　 方法:
　　 1：對人結腸癌細胞SW480進行體外培養(yǎng)。
　　 2：本試驗將FLNa基因質粒載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa,以脂

6、質體介導方式轉染SW480細胞。經G418篩選,獲得FLNa基因穩(wěn)定表達的SW480/FLNa細胞,同時,以不含F(xiàn)LNa基因質粒載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO質粒作為空載體轉染對照組細胞。
　　 3：反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western blot檢測3組細胞中FLNa基因導入:未轉染組野生型細胞(SW480)、轉染空載體組細胞(SW480/pcDNA3.1)和轉染FLNa cDNA組SW480細胞(S

7、W480/FLNa)。
　　 4：采用MTT試驗法檢測細胞的增殖能力并繪制細胞生長曲線,檢測細胞的存活和生長。
　　 5：依據劃痕損傷實驗、Transwell小室和Matrigel侵襲模型評價FLNa抑制人結腸癌SW480細胞侵襲和轉移能力。
　　 結果:
　　 1：在SW480細胞中,FLNa的表達載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa獲得穩(wěn)定表達。
　　 2：SW480/FLN

8、a細胞中FLNa的mRNA的表達水平均較野生型SW480細胞高,分別為(1.27±0.03)vs(0.14±0.02),P＜0.01。
　　 3：SW480/FLNa細胞中FLNa蛋白的表達水平均較野生型SW480細胞高,分別為(1.18±0.03)vs(0.25±0.02),P＜0.05。
　　 4：MTT試驗法檢測3組細胞(SW480、SW480/pcDNA3.1和SW480/FLNa)細胞生長曲線基本重疊,增殖能力

9、無差異。
　　 5：劃痕損傷實驗結果顯示:SW480組向劃痕處的遷移速度明顯快于SW480/FLNa組,而SW480與SW480/pcDNA3.1組間的遷移速度差異不明顯。
　　 6：Transwell小室遷移實驗和Matrigel侵襲實驗表明,SW480/FLNa組較SW480組穿膜/膠數量明顯減少(P＜0.05);SW480/pcDNA3.1組較SW480組穿膜/膠數量無差異(P＞0.05)。
　　 結論:<