脂質(zhì)體介導(dǎo)脆性組氨酸三聯(lián)體基因轉(zhuǎn)染對結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480凋亡的影響.pdf

1、背景: 結(jié)腸癌是近年來在國內(nèi)外發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢的腫瘤之一。手術(shù)仍是治療的關(guān)鍵手段，而術(shù)后放、化療對提高生存率作用有限。因此，尋求新的結(jié)腸癌早期診斷和治療的方法對于提高其手術(shù)切除率和生存率，改善生活質(zhì)量具有重要的意義。隨著腫瘤免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制已經(jīng)部份闡明，為結(jié)腸癌的基因治療提供了理論基礎(chǔ)。本課題組的前期研究證明脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因表達(dá)缺失在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重

2、要的促進(jìn)作用，但目前其應(yīng)用于基因治療總的效果仍不理想，許多還處于臨床前實(shí)驗階段，加上人體基因表達(dá)機(jī)制十分復(fù)雜，到目前為止有些環(huán)節(jié)還不清楚，需要繼續(xù)深入研究，以便更好地發(fā)揮基因治療的作用。外源性FHIT基因轉(zhuǎn)染入FHIT基因表達(dá)缺失的結(jié)腸癌中誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制一旦明確，將為結(jié)腸癌的治療提供全新的分子治療策略。 目的: 克隆人FHIT基因，構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒pRc/CMV2-FHlT；觀察FHIT基因轉(zhuǎn)染對腸癌細(xì)胞株S

3、W480細(xì)胞基因及蛋白表達(dá)的影響，了解FHIT基因誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生長周期阻滯情況；為將FHIT基因應(yīng)用于結(jié)腸癌的臨床治療奠定基礎(chǔ)。 方法: 1、提取人外周血總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)擴(kuò)增人FHITcDNA全長開放閱讀框序列，PCR產(chǎn)物與中間載體pGEM-T連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a，然后對單菌落進(jìn)行菌落PCR、限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測序。用EcoR Ⅰ將目的片段切下，

4、插入真核表達(dá)載體pRc/CMV2的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pRc/CMV2-FHIT，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a后進(jìn)行菌落PCR、酶切鑒定。 2、通過脂質(zhì)體將表達(dá)質(zhì)粒pRc/CMV2-FHIT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測FHIT mRNA水平的變化、Western blot測定培養(yǎng)液上清FHIT蛋白濃度、流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡能力的改變，同時設(shè)空白組以及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組作為對照。