hTERT啟動子調(diào)控的hNIS基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)放射性碘攝取和治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)核心啟動子調(diào)控的人鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體(hNIS)基因重組腺病毒，并靶向轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)。探討hTERT啟動子調(diào)控的hNIS基因介導(dǎo)放射性碘治療腫瘤的可能性。 方法： (1)從肝癌細(xì)胞HepG2基因組DNA中擴(kuò)增出hTERT核心啟動子序列，亞克隆至質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)，通過限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定。(2)hTERT核心啟動子亞克隆至含全長hNIS eDNA序列的質(zhì)粒載體FL*

2、-hNIS/pcDNA3，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶將hTERT-hNIS片段切出后連入穿梭質(zhì)粒載體pAdTraek，應(yīng)用Adeasy系統(tǒng)構(gòu)建出重組腺病毒Ad-hTERT-hNIS。同時，構(gòu)建CMV啟動子調(diào)控的hNIS重組腺病毒Ad-CMV-hNIS作為陽性對照，不含hNIS的重組腺病毒Ad-CMV作為陰性對照。 (3)應(yīng)用RT-PCR方法驗(yàn)證hTERT在轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性，Western blot驗(yàn)證EhNIS蛋白的表達(dá)，通過攝碘實(shí)驗(yàn)檢測

3、hNIS蛋白的功能。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)評價碘-131對轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的毒性作用。 結(jié)果：(1)成功克隆出hTERT核心啟動子，酶切和測序正確。(2)成功構(gòu)建重組腺病毒Ad-hTERT-hNIS、Ad-CMV-hNIS及Ad-CMV，并經(jīng)PCR驗(yàn)證正確。(3)RT-PCR證實(shí)hNIS cDNA能從Ad-hTERT-hNIS轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中擴(kuò)增出來。應(yīng)用hNIS單克隆抗體行Western blot分析，在55～77kDa之間見到特異性條帶。

4、 (4)碘攝取實(shí)驗(yàn)表明，Ad-hTERT-hNIS和Ad-CMV-hNIS轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞攝碘能力比陰性對照病毒Ad-CMV轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別提高了23和31倍，且攝碘能力可以被高氯酸鈉抑制。 (5)體外克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，Ad-hTERT-hNIS和Ad-CMV-hNIS轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞分別可以被碘-131殺死約70％和80％，而陰性對照病毒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染病毒組僅為10％。 結(jié)論：本研究成功克隆出hTERT核心啟動子，并