shRNA逆轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞BIU-87-ADM多藥耐藥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建由pSIREN-RetroQ-ZsGreeen載體介導(dǎo)針對(duì)MDR1基因的短發(fā)卡RNA(shRNA)真核表達(dá)載體，研究利用shRNA來逆轉(zhuǎn)膀胱腫瘤細(xì)胞BIU-87/ADM多藥耐藥性的可行性。
　　 方法：分別針對(duì)MDR1基因已知mRNA序列不同位點(diǎn)，選擇兩條靶序列，按BarnHI+Sense+Loop+Antisense+終止信號(hào)+EcorI結(jié)構(gòu)合成編碼shRNA的DNA序列及其反義序列，然后利用基因重組技術(shù)構(gòu)建靶向MD

2、R1shRNA真核表達(dá)載體，成功構(gòu)建后通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至膀胱腫瘤耐藥細(xì)胞BIU-87/ADM，利用RT-PCR檢測BIU-87/ADM細(xì)胞MDR1基因的表達(dá)，以及免疫組織化學(xué)檢測BIU-87/ADM細(xì)胞膜表面P-gp表達(dá)，同時(shí)利用MTT法檢測膀胱癌多藥耐藥細(xì)胞BIU-87/ADM對(duì)化療藥物阿霉素(ADM)的敏感性。最后，結(jié)果采用spss統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，組間均采用兩樣本t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：構(gòu)建成的重組質(zhì)粒p

3、SIREN-RetroQ-ZsGreeen-A和pSIREN-RetroQ-ZsGreeen-B經(jīng)酶切與測序證實(shí)構(gòu)建成功，無任何堿基突變；將成功構(gòu)建的2個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至BIU-87/ADM細(xì)胞，24小時(shí)后通過RT-PCR檢測顯示均明顯抑制BIU-87/ADM細(xì)胞株MDR1基因表達(dá)(P＜0.05)，細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄比值分別下降了72.57％和78.88％。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過免疫組織化學(xué)檢測顯示P-gp表達(dá)率分別為48.53±2.65

4、％和43.58±2.52％，顯著低于未轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)。同時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，利用MMT法檢測顯示膀胱癌耐藥株BIU-87/ADM對(duì)化療物ADM的敏感性明顯增強(qiáng)，對(duì)ADM藥物敏感性的相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率分別為52.02％和54.87％(P＜0.05)。此外，2個(gè)重組質(zhì)粒對(duì)逆轉(zhuǎn)膀胱癌多藥耐藥細(xì)胞BIU-87/ADM的效果無差異。
　　 結(jié)論：shRNA真核表達(dá)載體可明顯抑制BIU-87/ADM細(xì)胞MDR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄和P-gp蛋白