消癌解毒方逆轉(zhuǎn)肺腺癌細胞多藥耐藥的實驗研究.pdf

1、目的:
　　本研究旨在確定消癌解毒方對肺腺癌細胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，尋找出消癌解毒方對多藥耐藥蛋白的影響，并從分子生物學水平探究消癌解毒方對化療藥物多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)機制。
　　方法:
　　1.選擇肺腺癌細胞A549細胞、肺腺癌耐藥細胞A549/DDP細胞作為實驗細胞，并以流式細胞儀檢測細胞表面P-gp、MRP蛋白的表達率。
　　2.以MTT法測定消癌解毒方對A549/DDP細胞的劑量效應曲線，并根據(jù)實驗結(jié)果選取合適

2、的消癌解毒方實驗劑量。
　　3.實驗分為三組:A549細胞組、A549/DDP細胞組、A549/DDP細胞+消癌解毒方組。以順鉑、氟尿嘧啶、紫杉醇三種化療藥物分別作用于上述三組細胞，應用MTT比色法檢測細胞存活率的變化，評價上述三種化療藥物對三組細胞的生長抑制作用，并得出細胞的半數(shù)抑制率(IC50)，從而判斷化療藥物的敏感性，同時計算出消癌解毒方對肺腺癌耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。
　　4.以流式細胞儀檢測消癌解毒方對A549/DD

3、P表面P-gp蛋白、MRP蛋白的表達率以及細胞內(nèi)羅丹明123（Rho123）濃度的影響。
　　5.實時熒光定量PCR檢測各組細胞MDR1，MRP基因mRNA水平的變化。
　　6.統(tǒng)計方法:實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析:兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗分析。多組樣本比較采用One-way ANOVA比較各組細胞的差異;如果方差不齊，采用非參數(shù)檢驗比較組間差異，結(jié)果以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，P≤0.05認

4、為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.A549細胞及A549/DDP細胞均呈上皮樣單層排列，傳代周期為3-4天，兩種細胞對數(shù)生長期存活率均＞95％，形態(tài)上A549/DDP細胞與其親本細胞存在差異，光鏡下可見耐藥細胞體積略增大，細胞變形，并且多核巨細胞的數(shù)量明顯增加。A549細胞膜上P-gp蛋白的表達率為68.6％、MRP蛋白的表達率為69.0％; A549/DDP細胞膜上P-gp蛋白的表達率為74.3％，MRP蛋白的表達率為

5、82.6％。
　　2.對DDP、5-FU、Taxol這三種抗癌藥，A549/DDP細胞均顯示耐藥性，其IC50分別為81.30±3.88、199.1±17.91、10.49±1.64，而A549細胞相對敏感，IC50明顯下降(P=0.000)，分別為17.68±2.02、63.52±2.09、4.68±1.19。耐藥細胞A549/DDP較親本細胞A549對三種抗癌藥的耐藥倍數(shù)分別為4.60、3.13、2.24。經(jīng)10mg/ml的消

6、癌解毒方作用后耐藥細胞A549/DDP對各抗癌藥的敏感性增強，其IC50明顯下降(P≤0.001)，分別為34.55±1.01、73.03±12.0、4.61±0.31，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.35、2.72、2.27。
　　3.A549/DDP細胞經(jīng)消癌解毒方10mg/ml作用24h后，細胞表面的P-gp、MRP蛋白表達率較作用前下降，由74.3％下降至69.0％，MRP蛋白表達率由82.6％下降至76.5％。
　　4.在Rh

7、o123蓄積實驗，A549細胞內(nèi)Rho123熒光很強，表達率為56.5％，而A549/DDP細胞內(nèi)Rho123熒光很弱，表達率僅為9.6％，加消癌解毒方10mg/ml后，細胞內(nèi)熒光明顯增強，表達率為27.80％，提示消癌解毒方可明顯增加耐藥細胞對Rho123的蓄積。
　　5.實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，A549/DDP+10mg/ml消癌解毒方組MDR1基因的含量約為A549/DDP組的78.94％，逆轉(zhuǎn)率為21.06％; A54

8、9/DDP+10mg/ml消癌解毒方組MRP基因的含量約為A549/DDP組的76.40％，逆轉(zhuǎn)率為20.60％。
　　結(jié)論:
　　1.消癌解毒方在體外可明顯提高肺腺癌耐藥細胞對化療藥物的敏感性;
　　2.消癌解毒方在體外逆轉(zhuǎn)肺腺癌多藥耐藥的機制可能是通過減少MDR1、MRP基因的表達，從而抑制跨膜轉(zhuǎn)運蛋白的功能，阻止細胞內(nèi)化療藥物的泵出，增加細胞內(nèi)化療藥物的濃度，增強對耐藥細胞的殺傷作用;
　　3.通過本實驗證