CHD4蛋白與PTEN蛋白相互作用的鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:分別在細胞水平和體外檢測PTEN與Mi-2β/CHD4之間的相互作用,進一步明確其相互作用的結構域。
  研究方法:本課題擬在已有工作的基礎上,利用GSTpull-down、免疫共沉淀等方法,檢測PTEN與Mi-2β/CHD4之間的相互作用,通過構建截短體,明確結合核心結構域。采用PCR方法擴增CHD4的染色質調節(jié)區(qū)(CHD4-C)、解螺旋酶模序(CHD4-H)及DNA結合區(qū)(CHD4-D)基因片段,將目的基因片段插入原核表

2、達載體pGEX-5T構建GST標簽的重組質粒,陽性克隆行DNA序列測定。IPTG誘導GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H原核表達,谷胱甘肽瓊脂糖珠純化融合蛋白,表達產物Westernblot進行鑒定。用純化后GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白與PTEN-HIS進行GSTpull-down檢測CHD4蛋白與PTEN蛋白在體外相互作用及作用結構域。將HA-PCMV、HA-CH

3、D4真核質粒轉染到293T細胞中,應用免疫共沉淀技術檢測CHD4蛋白與PTEN蛋白在細胞水平的相互作用。
  結果:成功純化了較高純度的GST、GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白,并進行GSTpull-down結果表明CHD4蛋白與PTEN蛋白在體外相互作用且作用在CHD4染色質結合域端;免疫共沉淀技術檢測CHD4蛋白與PTEN蛋白在細胞水平存在相互作用,為進一步研究CHD4蛋白在染色質重塑中

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