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文檔簡介
1、近年來,國內(nèi)外學(xué)者研究證實對蝦中存在多種免疫因子、多條免疫信號傳導(dǎo)途徑,且不同的免疫因子之間、不同信號傳導(dǎo)途徑之間還存在重要的相互調(diào)控關(guān)系。其中,血藍(lán)蛋白(hemocyanin, HMC)是近年來在對蝦等無脊椎動物體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種具有多種免疫活性的多功能蛋白,但迄今為止,其在對蝦免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用和地位等尚不清楚。為此,本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)等策略對其進(jìn)行了深入、系統(tǒng)的探究,所獲主要研究結(jié)果如下:
1、
2、對蝦血藍(lán)蛋白相互作用蛋白的鑒定
采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)、生物質(zhì)譜(LC-MS/MS)等技術(shù)獲得與對蝦血藍(lán)蛋白相互作用蛋白61個,在此基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步通過蛋白相鄰的聚簇(COG)、Gent ontology(GO)等蛋白注釋分析以及PATHWAY數(shù)據(jù)庫篩選,發(fā)現(xiàn)12個免疫信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白可能與血藍(lán)蛋白相互作用。
2、對蝦血藍(lán)蛋白與谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶相互作用分析
為了進(jìn)一
3、步證實血藍(lán)蛋白與其相互作用蛋白之間的相互作用關(guān)系,我們選取血液凝結(jié)信號傳導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白——谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(transglutaminase, TGase)為研究對象進(jìn)行深入分析。
首先,采用基因克隆技術(shù)獲得TGase cDNA全長序列(2274 bp),序列分析顯示,其含有1個TGase同源保守結(jié)構(gòu)域和3個Ig-like區(qū)。繼而,通過原核表達(dá)、Ni-NTA柱分離純化TGase重組表達(dá)蛋白(rTGase,分子量為115kDa)。
4、最后,運(yùn)用 Far-Western-blotting、pull-down等技術(shù)進(jìn)一步證實 HMC確實可以與rTGase相互作用,與免疫共沉淀和質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。
3、對蝦血藍(lán)蛋白對TGase及凝結(jié)信號傳導(dǎo)通路效應(yīng)基因的調(diào)控關(guān)系研究
首先,采用real-time PCR比較分析病原脅迫下HMC和TGase基因表達(dá)的相關(guān)性,結(jié)果顯示,HMC和TGase基因表達(dá)量均先上升再下降,呈正相關(guān)關(guān)系。
繼而,對HMC m
5、RNA干擾沉默,比較分析HMC RNA干擾前后TGase和凝結(jié)蛋白(clotting protein, CP)基因表達(dá)的差異。結(jié)果表明,TGase和CP在HMC干擾后基因表達(dá)水平均比干擾前有不同程度的下降,提示 HMC對TGase、CP有著直接或間接的調(diào)控關(guān)系;同時,HMC干擾后對蝦血淋巴的凝結(jié)功能明顯下降,這可能與CP表達(dá)量的下降有關(guān),該結(jié)果進(jìn)一步說明HMC和CP之間可能存在調(diào)控關(guān)系。
最后,通過病原菌感染對蝦,比較分析HM
6、C干擾前后對蝦抵御病原菌的情況,結(jié)果表明,HMC干擾組對蝦的致死率比 HMC未干擾組高;同時,注射重組HMC(rHMC)可在一定程度上提高對蝦的存活率。
由此推測,血藍(lán)蛋白有可能通過與TGase相互作用對TGase及其血液凝結(jié)信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)控。
綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白可與12個免疫信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合,同時,對TGase及其血液凝結(jié)信號傳導(dǎo)通路效應(yīng)基因CP表現(xiàn)出較好的正調(diào)控作用
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