凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白相互作用蛋白的研究.pdf

1、近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究證實對蝦中存在多種免疫因子、多條免疫信號傳導(dǎo)途徑，且不同的免疫因子之間、不同信號傳導(dǎo)途徑之間還存在重要的相互調(diào)控關(guān)系。其中，血藍(lán)蛋白（hemocyanin, HMC）是近年來在對蝦等無脊椎動物體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種具有多種免疫活性的多功能蛋白，但迄今為止，其在對蝦免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用和地位等尚不清楚。為此，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)等策略對其進(jìn)行了深入、系統(tǒng)的探究，所獲主要研究結(jié)果如下：
　　1、

2、對蝦血藍(lán)蛋白相互作用蛋白的鑒定
　　采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）、生物質(zhì)譜（LC-MS/MS）等技術(shù)獲得與對蝦血藍(lán)蛋白相互作用蛋白61個，在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步通過蛋白相鄰的聚簇（COG）、Gent ontology（GO）等蛋白注釋分析以及PATHWAY數(shù)據(jù)庫篩選，發(fā)現(xiàn)12個免疫信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白可能與血藍(lán)蛋白相互作用。
　　2、對蝦血藍(lán)蛋白與谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶相互作用分析
　　為了進(jìn)一

3、步證實血藍(lán)蛋白與其相互作用蛋白之間的相互作用關(guān)系，我們選取血液凝結(jié)信號傳導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白——谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（transglutaminase, TGase）為研究對象進(jìn)行深入分析。
　　首先，采用基因克隆技術(shù)獲得TGase cDNA全長序列（2274 bp），序列分析顯示，其含有1個TGase同源保守結(jié)構(gòu)域和3個Ig-like區(qū)。繼而，通過原核表達(dá)、Ni-NTA柱分離純化TGase重組表達(dá)蛋白（rTGase，分子量為115kDa）。

4、最后，運(yùn)用 Far-Western-blotting、pull-down等技術(shù)進(jìn)一步證實 HMC確實可以與rTGase相互作用，與免疫共沉淀和質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。
　　3、對蝦血藍(lán)蛋白對TGase及凝結(jié)信號傳導(dǎo)通路效應(yīng)基因的調(diào)控關(guān)系研究
　　首先，采用real-time PCR比較分析病原脅迫下HMC和TGase基因表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，HMC和TGase基因表達(dá)量均先上升再下降，呈正相關(guān)關(guān)系。
　　繼而，對HMC m

5、RNA干擾沉默，比較分析HMC RNA干擾前后TGase和凝結(jié)蛋白（clotting protein, CP）基因表達(dá)的差異。結(jié)果表明，TGase和CP在HMC干擾后基因表達(dá)水平均比干擾前有不同程度的下降，提示 HMC對TGase、CP有著直接或間接的調(diào)控關(guān)系；同時，HMC干擾后對蝦血淋巴的凝結(jié)功能明顯下降，這可能與CP表達(dá)量的下降有關(guān)，該結(jié)果進(jìn)一步說明HMC和CP之間可能存在調(diào)控關(guān)系。
　　最后，通過病原菌感染對蝦，比較分析HM

6、C干擾前后對蝦抵御病原菌的情況，結(jié)果表明，HMC干擾組對蝦的致死率比 HMC未干擾組高；同時，注射重組HMC（rHMC）可在一定程度上提高對蝦的存活率。
　　由此推測，血藍(lán)蛋白有可能通過與TGase相互作用對TGase及其血液凝結(jié)信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)控。
　　綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白可與12個免疫信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合，同時，對TGase及其血液凝結(jié)信號傳導(dǎo)通路效應(yīng)基因CP表現(xiàn)出較好的正調(diào)控作用