萊氏野村菌Nrsod1和Nrsod2基因的克隆與功能研究.pdf

1、萊氏野村菌(Nomuraea rileyi= Metarhizium rileyi)是全世界廣泛分布的環(huán)境友好型生物防治真菌，主要侵染夜蛾科的害蟲。其分生孢子是真菌殺蟲劑的有效成分，但分生孢子在常規(guī)的真菌培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量低、且需要光照等因素限制了該菌的規(guī)?；a(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用。本實驗室通過液體發(fā)酵成功誘導(dǎo)出萊氏野村菌微菌核（王中康，2012，ZL2011103033145），微菌核（microsclerotium，MS）是在特定條件下由菌絲

2、的大量聚集纏繞特化形成的一種休眠繁殖體結(jié)構(gòu)，其作為害蟲生防接種體，萌發(fā)生長過程快、抗逆性強、貨架期長、穩(wěn)定性高等優(yōu)良特性，為新的萊氏野村菌殺蟲制劑的創(chuàng)制提供了全新的來源。前期實驗室工作已經(jīng)證實，微菌核的形成是一種氧化脅迫的過程，微菌核的形成伴隨著色素的沉淀、活性氧（ROS）的大量產(chǎn)生以及大量氧化脅迫相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，對這一調(diào)控通路的研究可為開發(fā)高毒力的萊氏野村菌生防制劑提供重要的理論依據(jù)。本實驗從已建立的 N.rileyi轉(zhuǎn)錄組文庫中

3、篩選出與微菌核誘導(dǎo)形成相關(guān)的兩個上調(diào)表達(dá)的Cu/Zn-sod基因，分別命名為Nrsod1和Nrsod2，并通過基因敲除的方法，探索Nrsod1、Nrsod2基因功能，主要研究結(jié)果如下：
　?、偃R氏野村菌sod基因的克隆與鑒定
　　克隆得到Nrsod1基因ORF全長564bp，編碼187個氨基酸，含有一個內(nèi)含子（75bp）；Nrsod2基因ORF全長915bp，編碼304個氨基酸，沒有內(nèi)含子。通過同源性比對以及構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行系

4、統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示：兩個基因編碼的氨基酸序列與綠僵菌屬的sod序列同源性較高，同源性在92％以上，其氨基酸序列中共同具有sod超家族序列保守功能區(qū)。
　?、谌笔蛔冝D(zhuǎn)化子篩選與驗證
　　利用FPNI-PCR的方法擴增得到Nrsod1、Nrsod2基因的全長序列以及5'端和3'端側(cè)翼序列，將側(cè)翼序列重組到Pzp-Ptrpc-Hph-Knock載體上，構(gòu)建敲除載體Pzp-hph-Nrsod1、Pzp-hph-Nrsod2。轉(zhuǎn)入

5、農(nóng)桿菌，利用萊氏野村菌芽生孢子作為受體細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以潮霉素抗性作為篩選標(biāo)記，通過PCR驗證轉(zhuǎn)化子，并通過測序分析證明，成功獲得2個基因的缺失突變轉(zhuǎn)化子，命名為△Nrsod1、△Nrsod2。
　?、廴笔蛔凅w表型分析
　　缺失突變體表型分析結(jié)果表明：與野生型相比，△Nrsod1和△Nrsod2酵母態(tài)向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)化的時間推遲1.5d；對菌落生長速率、產(chǎn)孢量和萌發(fā)率測定后發(fā)現(xiàn)，△Nrsod1和△Nrsod2產(chǎn)孢量分別下降2

6、1%和54%；突變體分生孢子萌發(fā)率和菌絲生長速率與野生型相比并不顯著?？鼓嫘苑治鲲@示：在鹽脅迫、剛果紅脅迫、氧脅迫條件下，基因缺失菌株均各自顯示出不同程度的生長缺陷，其中△Nrsod2缺陷更為明顯，其中甲萘醌完全抑制其生長；兩個sod基因缺失均未影響分生孢子對高低溫脅迫的耐受力；紫外輻射處理下突變體分生孢子萌發(fā)率與野生型相比顯著降低，說明sod缺失使得孢子對 UV-B敏感性提高。對萊氏野村菌微菌核形成影響分析發(fā)現(xiàn)：△Nrsod1和△Nr

7、sod2突變菌株微菌核生物量分別降低34.6%和51.5%；微菌核數(shù)量分別降低45%和72.5%；顯微觀察發(fā)現(xiàn)，△Nrsod1和△Nrsod2微菌核形成延遲，菌核減小，其中△Nrsod2菌核形態(tài)不規(guī)則。
　?、躶od基因表達(dá)模式分析
　　萊氏野村菌sod基因表達(dá)模式分析表明：Nrsod1和Nrsod2在3d（微菌核形成期）均上調(diào)表達(dá)，表明Nrsod1和Nrsod2均參與微菌核的發(fā)育形成過程；而Nrsod2在5d（微菌核成熟期

8、）再次上調(diào)表達(dá)，說明Nrsod2參與了微菌核形成以及成熟的整個過程。對突變體中Nrsod1和Nrsod2的定量檢測研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)Nrsod1基因缺失時，Nrsod2基因表達(dá)量顯著降低，當(dāng)Nrsod2基因缺失時，Nrsod1基因表達(dá)量顯著降低；Nrsod1和 Nrsod2基因的缺失，不會刺激對方基因發(fā)生補償性轉(zhuǎn)錄激活，而是一個基因的缺失抑制另一個基因的表達(dá)。對sod基因上下游相關(guān)基因定量分析顯示：Nrsod1和Nrsod2在微菌核形成中不僅

9、僅自身發(fā)揮重要作用，也通過調(diào)控NOX復(fù)合體和CAT家族有關(guān)基因的活性進(jìn)而影響MS的形成。
　?、輘od突變體毒力測定
　　對sod突變體毒力測定結(jié)果顯示：Nrsod2缺失突變體孢子毒力顯著降低。體表接種侵染時，突變體半致死時間較野生型顯著延遲；體內(nèi)注射侵染發(fā)現(xiàn)，Nrsod1和Nrsod2基因的敲除突變體的半致死時間（LT50）分別為為8.5d、10d，而野生型LT50為7d，Nrsod2突變體半致死時間較野生型顯著延遲3d；

10、14后，野生型侵染斜紋夜蛾幼蟲全部死亡，Nrsod2突變體幼蟲仍有30%的存活率。
　　結(jié)論：通過構(gòu)建敲除載體和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，我們成功獲得到萊氏野村菌Nrsod1和Nrsod2基因的突變菌株。證明Nrsod1和Nrsod2基因在調(diào)控產(chǎn)孢、生長發(fā)育、應(yīng)對逆境脅迫、兩型轉(zhuǎn)換、微菌核形成等過程中發(fā)揮不同程度的作用。qPCR研究基因表達(dá)證實，兩個基因之間存在功能的冗余和相互影響，并能通過調(diào)控NOX復(fù)合體和CAT家族相關(guān)基因的活性進(jìn)