深低溫冷凍對氣管抗原遞呈細(xì)胞及氣管組織細(xì)胞活力的影響.pdf

1、目的:因先天性疾病、炎癥、腫瘤及其他原因引起的氣管廣泛性狹窄而需行長段氣管的切除與重建在臨床上并不少見。但氣管由于其特殊的解剖生理特點(diǎn),當(dāng)其切除長度超過6cm時(shí)由于張力過大將無法吻合。為保持氣道的暢通,各種方式的氣道重建應(yīng)運(yùn)而生。目前有人工氣管替代、自體組織代氣管、生物醫(yī)學(xué)與組織工程重建氣管及氣管移植。其中氣管移植被認(rèn)為是氣管重建的首選方法。由于氣管移植和其他器官一樣具有免疫原性,移植后會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。對于需要進(jìn)行氣管移植的患者來說

2、,大多數(shù)是腫瘤患者應(yīng)用免疫抑制劑不僅影響術(shù)后恢復(fù),并可導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)。因而近年來深低溫凍儲后的氣管移植備受矚目。冷凍包括低溫(高于-80℃)、深低溫(-80℃)、超深低溫(-196℃)以及反復(fù)凍融等方法。冷凍后的組織可以保持其原有的活性和組織完整性,并能削減其免疫原性,這樣既解決了供體的保存問題,又解決了移植后免疫排斥反應(yīng)的控制問題。
　　 為了解超深低溫(-196℃)條件下氣管組織細(xì)胞的免疫原性及存活力,我們利用免疫組化方法觀察

3、大鼠氣管組織的樹突狀細(xì)胞,以明確其免疫原性的變化;采用3H-TdR(3H-胸腺嘧啶核苷)體外培養(yǎng)的方法檢測細(xì)胞活力。
　　 方法:48只SD大鼠,體重200-250g,購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。隨機(jī)分為6組、將其中一組做對照組。切取2.5-3.5cm氣管,切取其邊緣,用免疫組化(OX-62標(biāo)記)檢測樹突狀細(xì)胞的表達(dá),將氣管段分別移入注滿冷凍保護(hù)液的凍儲管(2ml)中,每管中放一段氣管,使冷凍保護(hù)劑充分浸潤氣管,旋緊管帽。放置

4、于4℃冰箱中平衡4小時(shí),采用程控降溫儀程序降溫,降溫速率1℃/分,降至-80℃迅速投入液氮中保存。24小時(shí),第10天、20天、30天、60天分別取出8只切取其邊緣4-6個(gè)氣管軟骨環(huán),經(jīng)復(fù)溫后與新鮮氣管做比較,將剩余氣管采用體外培養(yǎng)的方法分析細(xì)胞功能和活力,并檢測樹突狀細(xì)胞的表達(dá)。
　　 組織病理采用石蠟切片HE染色觀察,免疫組化采用SP法。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。
　　 結(jié)果:
　　 1對比凍儲

5、后的氣管組織和新鮮組織的組織學(xué)檢查。超深低溫保存后的氣管復(fù)溫后和新鮮氣管相比在外觀無明顯差別,稍顯蒼白。正常氣管結(jié)構(gòu)的HE染色可見氣管黏膜表面排列整齊的假復(fù)層柱狀纖毛上皮細(xì)胞,黏膜及黏膜下層基質(zhì)細(xì)胞、腺細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞保存完好。軟骨部分結(jié)構(gòu)致密,可見軟骨細(xì)胞單獨(dú)或多個(gè)生長于軟骨陷窩內(nèi)。冷凍后的各組氣管結(jié)構(gòu)基本保持完整,隨著時(shí)間的延長部分出現(xiàn)纖毛脫落,上皮破壞,軟骨變化不大。
　　 2對比凍儲后的氣管組織和新鮮組織的免疫組化結(jié)果

6、,新鮮氣管組織在氣管冠狀位切片可觀察到上皮層內(nèi)至基膜層組織有少量棕色深染的樹突狀細(xì)胞胞體分布,在上皮細(xì)咆層間為深淺不一的棕色染色,在粘膜下層混合腺中也有深染樹突狀細(xì)胞,平行氣管長軸的基膜層切片可以觀察到大量樹突狀細(xì)胞交織成網(wǎng)狀,軟骨層沒有陽性染色。凍存后氣管則組織水腫,樹突狀細(xì)胞腫脹,樹突狀突起著色淡染,突起遠(yuǎn)端著色不清,細(xì)胞分布稀疏。OX-62是大鼠樹突狀細(xì)胞比較特異的標(biāo)志物,在正常新鮮組,其陽性表達(dá)共8例,其中強(qiáng)陽性6例,陽性1例,

7、弱陽性1例;在冷凍后24小時(shí),其陽性表達(dá)共8例,其中強(qiáng)陽性4例,陽性2例,弱陽性2例,陰性O(shè)例:在冷凍后10天,其陽性表達(dá)共8例,其中強(qiáng)陽性5例,陽性2例,弱陽性1例,陰性0例;在冷凍后20天,其陽性表達(dá)共7例,其中強(qiáng)陽性1例,陽性3例,弱陽性4例,陰性0例;在冷凍后30天,其陽性表達(dá)共5例,其中強(qiáng)陽性0例,陽性1例,弱陽性4例,陰性3例;在冷凍后60天,其陽性表達(dá)共1例,其中強(qiáng)陽性0例,陽性O(shè)例,弱陽性1例,陰性7例;結(jié)果顯示,OX-

8、62在冷凍24小時(shí)、冷凍10天與正常組相比差異不顯著(P＞0.05),OX-62在冷凍20天、30天、60天組表達(dá)顯著低于正常組(P＜0.05,且隨著冷凍時(shí)間的延長,其表達(dá)逐漸遞減。
　　 33H-TdR摻入率在冷凍前測定值為35.18±3.30CPM/mg,冷凍后24小時(shí)為28.39±3.20 CPM/mg,約占冷凍前的80％;冷凍后10天為26.28±2.62CPM/mg,約占冷凍前的74％;冷凍后20天為25.05±2.8

9、5CPM/mg,約占冷凍前的71％;冷凍后30天為24.85+3.01CPM/mg,約占冷凍前的70.6％;冷凍后60天為24.59±2.44CPM/mg,約占冷凍前的65.2％。
　　 結(jié)論:
　　 1凍儲氣管的OX-62表達(dá)下降(≥20天),統(tǒng)計(jì)學(xué)意義相差顯著,提示凍儲氣管的免疫原性降低可能是由于樹突狀細(xì)胞明顯減少,其功能和活性降低,樹突狀細(xì)胞在凍儲過程中受到了損傷。
　　 23H-TdR在細(xì)胞增殖過程中合成

10、到染色體中,細(xì)胞死亡后不會吸收,因此可作為細(xì)胞活力的標(biāo)志。通過對3H-TdR摻入率檢測結(jié)果分析,氣管低溫保存后24小時(shí)其摻入率就明顯降低,此后降低逐漸變緩。
　　 3綜合我們的研究結(jié)果表明,通過檢測冷凍后不同時(shí)段的樹突狀細(xì)胞表達(dá)及樹突狀細(xì)胞的變化以及冷凍后氣管組織細(xì)胞的活力,發(fā)現(xiàn)冷凍60天的氣管免疫原性最低,但氣管組織細(xì)胞活力只有冷凍前的65％,冷凍24小時(shí)的氣管組織細(xì)胞活力是冷凍前的80％,但免疫原性很高;綜合比較后冷凍30天