表達(dá)空腸彎曲菌保護性抗原cfrA、cjaA基因的重組乳酸菌的構(gòu)建及口服免疫研究.pdf

1、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是彎曲菌屬的一種微需氧革蘭氏陰性菌，可在宿主腸道中定殖和感染引起多種疾病，如感染人引起腸炎和腹瀉，是人最重要的食源性病原菌之一?？刂萍仪輳澢奈廴臼墙档腿烁腥驹摼钪苯佑行У氖侄?，本研究擬結(jié)合特異性與非特異性免疫，將空腸彎曲菌保護性抗原基因?qū)胧称芳壢樗峋磉_(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建表達(dá)保護性抗原的重組乳酸菌口服免疫制劑，達(dá)到降低雞腸道空腸彎曲菌定殖水平的目的。
　　本研究首先將空腸彎曲菌

2、腸菌素受體蛋白CfrA編碼基因?qū)胧称芳壢樗崛榍蚓磉_(dá)系統(tǒng)，將構(gòu)建的重組乳酸乳球菌口服免疫雞，達(dá)到降低空腸彎曲菌在雞腸道中定殖的目的。利用PCR分別擴增空腸彎曲菌CfrA全基因及其N端片段，插入食品級表達(dá)載體pNZ8149多克隆位點并轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ3900，通過Western blot鑒定重組菌株CfrA蛋白表達(dá)情況，篩選nisin濃度、溫度、時間等誘導(dǎo)條件優(yōu)化重組蛋白表達(dá)水平；將重組乳酸乳球菌經(jīng)口服免疫 SPF雞，免疫后分別測定乳

3、酸乳球菌自雞體內(nèi)的排出情況、誘導(dǎo)CfrA血清抗體和粘膜抗體水平，最后將空腸彎曲菌口服攻毒免疫后的雞，測定雞泄殖腔棉拭子中空腸彎曲菌的數(shù)目來判定口服免疫效果。Western blot檢測顯示CfrA全基因及其N端片段均可在重組乳酸乳球菌胞內(nèi)可溶性表達(dá)，不能分泌至胞外，篩選的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為nisin濃度25 ng/mL、溫度37℃、時間1h。口服乳酸乳球菌10d內(nèi)自雞體完全排空；雞口服免疫后可產(chǎn)生CfrA蛋白特異性的血清IgG和腸粘膜s

4、IgA抗體；重組乳酸乳球菌口服免疫后空腸彎曲菌在雞體內(nèi)的增殖速度顯著低于對照組。本研究成功構(gòu)建了重組CfrA蛋白的食品級乳酸乳球菌誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)；表達(dá)CfrA蛋白的重組乳酸乳球菌口服免疫雞對空腸彎曲菌在雞腸道的定殖具有一定的抑制作用。在空腸彎曲菌CfrA蛋白重組表達(dá)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建CjaA及CjaA-LTB蛋白重組乳酸乳球菌分泌性表達(dá)系統(tǒng)。利用PCR擴增乳酸乳球菌-MG1363-未知分泌蛋白Usp45基因分泌信號肽的編碼序列 SPusp45

5、，克隆到食品級載體 pNZ8149中，以空腸彎曲菌主要免疫保護性抗原CjaA蛋白的基因片段為靶基因，并插入大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位基因(LTB)，構(gòu)建了表達(dá)空腸彎曲菌 cjaA基因和融合表達(dá) cjaA-LTB的重組分泌性乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)，并對免疫效果進行比較分析，Western blot檢測顯示cjaA基因可在重組乳酸乳球菌胞內(nèi)可溶性表達(dá)，口服乳酸乳球菌7d內(nèi)自雞體慢慢排空；雞口服免疫后可產(chǎn)生 CjaA蛋白特異性的血清 IgG和腸