缺氧誘導(dǎo)因子-1α的siRNA抑制肝癌細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一，因其起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)已多屬晚期。目前HCC治療手段有限，手術(shù)切除率低，術(shù)后復(fù)發(fā)率高?；蛑委熥鳛橐环N新癌癥的治療手段，已成為醫(yī)學(xué)研究的方向，其中新興的RNA干擾（RNAi）技術(shù)在基因治療方面具有較好應(yīng)用前景。然而，RNAi處于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究階段，分子機(jī)制目前尚未完全清晰，也未形成一套特異、高效的治療體系。本實(shí)驗(yàn)擬通過實(shí)驗(yàn)方法找到針對(duì)肝癌細(xì)胞缺氧

2、誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的有特異干擾作用的siRNA序列和一套合適有效的RNA干擾策略。為以后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究以及基因治療藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 第一部分：HIF-1α靶向siRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 目的：利用基因重組技術(shù)構(gòu)建四組HIF-1α靶向siRNA重組表達(dá)載體，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：利用網(wǎng)絡(luò)資源并按要求設(shè)計(jì)出四條目的siRNAs并各自插入到載體質(zhì)粒pGenesil-1

3、.1 中分別為：siRNA1(S1)、siRNA2（S2）、siRNA陰性（SN）、siRNA空白（SB)。經(jīng)細(xì)菌篩選、擴(kuò)增后運(yùn)用酶切和基因測序技術(shù)檢驗(yàn)重組序列是否符合設(shè)計(jì)要求。
　　 結(jié)果：質(zhì)粒經(jīng)酶切后兩條片段大小均符合設(shè)計(jì)要求；四個(gè)質(zhì)經(jīng)粒基因測序驗(yàn)證基因序列完全正確。
　　 結(jié)論：HIF-1α靶向siRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建成功。
　　 第二部分：HIF-1α的siRNA重組質(zhì)粒抑制肝癌細(xì)胞的生長
　　

4、 目的：篩選出對(duì)肝癌HIF-1α有干擾效果的siRNA序列，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究以及基因藥物研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：四組重組載體經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000包埋后轉(zhuǎn)染到缺氧環(huán)境的肝癌細(xì)胞株bel-7402中。運(yùn)用RT-PCR檢測HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平以及細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察肝癌細(xì)胞生長受抑制情況。
　　 結(jié)果：其中S2組質(zhì)粒能抑制目的基因HIF-1α的轉(zhuǎn)錄，S1、SN、均不能抑制HIF-1α的mRNA轉(zhuǎn)錄；其中