BMP-7拮抗缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞株EMT的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)
　　 目的:探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)與肝癌之間的關(guān)系。
　　 方法:用RT-PCR和Western-Blot法檢測20例肝癌組織和16例癌旁組織中BMP-7的mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:①RT-PCR 結(jié)果顯示BMP-7在肝癌組織中呈高表達(dá)，陽性率為70[％](14/20),平均灰光密度值為1.049±0

2、.082，癌旁組織BMP-7弱表達(dá)或無表達(dá)，弱表達(dá)的陽性率為50[％](8/16)平均光密度值為0.741±0.107，P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②Western-Blot結(jié)果與RT-PCR 一致，肝癌組織中BMP-7的陽性率為65[％](13/20)，平均光密度值為1.191±0.137；癌旁組織BMP-7陽性率為37.5[％](6/16),平均光密度值為0.515±0.066，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)

3、論:BMP-7在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，可能與肝癌的發(fā)生或發(fā)展有關(guān)。
　　 第二部分：缺氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721間質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　 目的:探討缺氧(O2 濃度1[％])是否能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株由上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞表型(EMT)，以及細(xì)胞侵襲能力的改變。
　　 方法:缺氧(濃度1[％])條件下培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，經(jīng)歷0h，6h，12h，24h后，用RT-PCR和Western-Bl

4、ot法檢測上皮表型標(biāo)志物E-鈣粘蛋白和其調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)情況，檢測間質(zhì)表型標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)情況，Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)比較侵襲能力的變化，觀察缺氧誘導(dǎo)的EMT效應(yīng)。
　　 結(jié)果:缺氧(O2 濃度1[％])培養(yǎng)0h，6h，12h，24h 后，RT-PCR結(jié)果顯示，SMMC-7721細(xì)胞可呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的E-Cadherin mRNA表達(dá)減少；四個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測值分別為1.299±0.095；1.051±0

5、.152；0.714±0.059；0.542±0.092，與對(duì)照組相比較，除0h之外，差異顯著(P<0.05)，Snail分別為0.189±0.021；0.317±0.027；0.562±0.051；0.715±0.053，Vimentin分別為0.182±0.046；0.306±0.042；0.546±0.054；0.773±0.064，表達(dá)量均逐漸增多，與對(duì)照組相比較，除0h之外，差異明顯(P<0.05)。四個(gè)時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)E-Ca

6、dherin分別為：0.806±0.093；0.675±0.102；0.484±0.041；0.456±0.074，Vimentin分別為：0.471±0.091；0.692±0.087；0.827±0.113；0.831±0.057，與mRNA表達(dá)一致，除0h之外，與對(duì)照組相比較，差異顯著(P<0.05)。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)顯示穿過transwell濾膜的細(xì)胞數(shù)增多，四個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測值分別為32.33±3.22；39.34±4

7、.04；57.67±2.52；76.67±7.09，除0h外，與對(duì)照組相比較，差異顯著(P<0.05)。
　　 結(jié)論:SMMC-7721在氧氣濃度1[％]的條件下發(fā)生EMT，上皮表型標(biāo)志物E-鈣粘蛋白表達(dá)減少，調(diào)控E-鈣粘蛋白的抑制轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)增加，間質(zhì)表型標(biāo)志物Vimentin表達(dá)增加，細(xì)胞黏附性下降，運(yùn)動(dòng)侵襲能力增強(qiáng)。
　　 第三部分：骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7干預(yù)缺氧誘導(dǎo)EMT模型
　　 目的:探討B(tài)MP

8、-7對(duì)缺氧誘導(dǎo)的EMT的效應(yīng)。
　　 方法:設(shè)置空白對(duì)照組(正常條件培養(yǎng))；第二組缺氧誘導(dǎo)組(氧濃度1[％]條件培養(yǎng))；第三組為BMP-7干預(yù)組(用含BMP-7的培養(yǎng)基在氧濃度1[％]條件下培養(yǎng)SMMC-7721)。培養(yǎng)24h后，用RT-PCR和Western-Blot法檢測上皮表型標(biāo)志物E-鈣粘蛋白及其調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)情況，檢測間質(zhì)表型標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)情況，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)比較侵襲能力的變化，

9、觀察BMP-7對(duì)缺氧誘導(dǎo)EMT的效應(yīng)。
　　 結(jié)果:BMP-7(50ng/ml)干預(yù)缺氧誘導(dǎo)EMT模型24h后，與缺氧誘導(dǎo)組(E-Cad0.542±0.092；Snail 0.715±0.053；Vimentin 0.773±0.064)相比較，E-Cadherin mRNA表達(dá)明顯升高(2.26±0.176)，而Snail(0.379±0.053)和Vimentin(0.514±0.069)表達(dá)降低，P<0.05；與缺氧誘導(dǎo)組

10、(E-Cad 0.456±0.074；Vimentin 0.831±0.057)相比較，蛋白的表達(dá)與mRNA 一致(E-Cadherin 0.776±0.078，Vimentin 0.480±0.091)，P<0.05；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對(duì)照組(31.67±4.73)比較，BMP-7干預(yù)組侵襲能力略有上升(33.34±5.86)，P>0.05，與缺氧誘導(dǎo)組(75.43±7.76)相比，BMP-7干預(yù)組侵襲能力明顯下降