沉默缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α基因?qū)σ暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤生長與凋亡的影響.pdf

1、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Retinoblastoma，RB)是所有兒童實體腫瘤中最常見和最主要的眼內(nèi)惡性腫瘤，其腫瘤發(fā)生率約為1∶15000。對患兒的視力與生命都有嚴(yán)重威脅。腫瘤缺氧微環(huán)境在多數(shù)實體腫瘤中普遍存在，腫瘤細(xì)胞對缺氧的適應(yīng)是腫瘤形成過程中一個關(guān)鍵的步驟。缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1)是由腫瘤內(nèi)部缺氧所激活的一種轉(zhuǎn)錄因子，受多種癌基因、抑癌基因和生長因子的調(diào)節(jié)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲

2、轉(zhuǎn)移以及血管化形成等多種生物學(xué)特性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1在多種惡性實體腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。鑒于HIF-1在腫瘤許多生物學(xué)行為中所起的關(guān)鍵性作用，近幾年以HIF-1為基因靶點的抗腫瘤方案已經(jīng)成為腫瘤治療研究的熱點之一。然而，HIF-1在RB中的表達(dá)及意義目前在國內(nèi)外的研究文獻(xiàn)中并不多見，其對RB的生物學(xué)行為的影響還有待進(jìn)一步深入探討與了解。本研究以腫瘤缺氧微環(huán)境理論為依據(jù)，通過RNA干擾技術(shù)沉默缺氧誘導(dǎo)

3、因子HIF-1α基因表達(dá)，分別在體外與體內(nèi)水平觀察HIF-1α基因沉默對人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞與裸鼠RB移植瘤致瘤性的影響，旨在為以缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α為靶點的RB抗腫瘤基因治療提供理論基礎(chǔ)與實驗依據(jù)。
　　第一部分缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其意義
　　目的：
　　了解缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α在人RB腫瘤組織中的表達(dá)情況以及HIF-1α表達(dá)與RB的病理分型和臨床分期之間的關(guān)

4、系;探討缺氧對RB細(xì)胞株中HIF-1α基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平的影響。
　　方法：
　　1、應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測32例人RB腫瘤組織標(biāo)本與11例正常人視網(wǎng)膜組織標(biāo)本中HIF-1α的表達(dá)情況。
　　2、利用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件，通過卡方檢驗分析HIF-1α表達(dá)與RB病理分型和臨床分期之間的關(guān)系。
　　3、應(yīng)用RT-PCR方法從轉(zhuǎn)錄水平分別檢測人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1與HOX-Rb44細(xì)胞株中HI

5、F-1αmRNA的表達(dá)情況。
　　4、應(yīng)用Westernblotting方法從蛋白表達(dá)水平分別檢測人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1與HOX-Rb44細(xì)胞株中HIF-1α蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組織化學(xué)檢測顯示，HIF-1α在人RB腫瘤組織中高表達(dá)，陽性表達(dá)率為84.38％;在正常人視網(wǎng)膜組織中低表達(dá)，陽性表達(dá)率為9.09％(P＜0.01)。
　　2、統(tǒng)計學(xué)分析顯示，HIF-1α陽性表達(dá)率在分化型

6、RB與未分化型RB腫瘤組織中差異無顯著性(P＞0.05);臨床Ⅰ期RB組織中HIF-1α陽性表達(dá)率與臨床Ⅱ期、Ⅲ期相比差異均具有顯著性(P＜0.01)。
　　3、RT-PCR檢測顯示，在人RB細(xì)胞系WERI-Rb-1和HOX-Rb44兩種細(xì)胞株中，無論在缺氧條件下或常氧條件下HIF-1αmRNA均呈陽性表達(dá);兩種RB細(xì)胞株中HIF-1αmRNA表達(dá)水平在低氧組與常氧組之間差異均無顯著性(P＞0.05)。
　　4、Wester

7、nblotting檢測顯示，在人RB細(xì)胞系WERI-Rb-1和HOX-Rb44兩種細(xì)胞株中，常氧條件下HIF-1α蛋白均呈弱陽性表達(dá)，低氧條件下HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào);兩種RB細(xì)胞株中HIF-1α蛋白表達(dá)水平在低氧組與常氧組之間差異均具有顯著性(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、HIF-1α在人RB腫瘤組織中高表達(dá)，而在人正常視網(wǎng)膜組織中不表達(dá)或弱陽性表達(dá);HIF-1α陽性表達(dá)率與人RB的病理學(xué)分型無關(guān)，而與R

8、B的臨床分期正相關(guān)。
　　2、缺氧主要在蛋白表達(dá)水平上明顯增加RB細(xì)胞株中HIF-1α基因的表達(dá)，而缺氧對RB細(xì)胞株中HIF-1α基因的mRNA表達(dá)水平并無明顯影響。
　　第二部分針對HIF-1α基因的RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及其抑制效果檢測
　　目的：
　　構(gòu)建特異性針對HIF-1α基因的RAN干擾質(zhì)粒(HIF-1αsiRNA)，并檢測該重組質(zhì)粒對RB細(xì)胞株WERI-Rb-1細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)的抑制效果;為HI

9、F-1α基因的功能研究提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)手段。
　　方法：
　　1、設(shè)計3條針對HIF-1α和1條陰性對照的寡核苷酸序列，并將其與酶切后的空白質(zhì)粒連接，構(gòu)建3條特異性針對HIF-1α的RNA干擾重組質(zhì)粒與1條陰性RNA干擾重組質(zhì)粒。
　　2、通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RB細(xì)胞系WERI-Rb-1細(xì)胞株，利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測各種轉(zhuǎn)染試劑對該重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果。
　　3、利用RT-PCR與Western

10、blotting方法分別檢測3條特異性針對HIF-1α的RNA干擾重組質(zhì)粒對WERI-Rb-1細(xì)胞株中HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)的抑制效果。
　　結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建了3條特異性針對HIF-1α的RNA干擾質(zhì)粒pRNAT-HIF-1αsiRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ與1條陰性RNA干擾質(zhì)粒pRNAT-NegsiRNA;經(jīng)基因測序檢測證明，重組質(zhì)粒DNA片段序列全部與Genebank數(shù)據(jù)庫提供的HIF-1α序列完全一致，無堿基缺失

11、和錯位。
　　2、FCM檢測顯示，經(jīng)納米高分子聚合物轉(zhuǎn)染試劑EntransterTMR轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒pRNAT-HIF-1αsiRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ與pRNAT-NegsiRNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分別為91.23％、90.54％、94.01％與89.76％，經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為62.14％。EntransterTMR轉(zhuǎn)染各組和Lipofectamine轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率分別

12、與空白對照組相比各組間差異均有顯著性(P＜0.01);EntransterTMR轉(zhuǎn)染各組與Lipofectamine轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率差異均有顯著性(P＜0.05)。
　　3、RT-PCR方法檢測顯示，三組分別轉(zhuǎn)染了pRNAT-HIF-1αsiRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ重組RNA干擾質(zhì)粒的WERI-Rb-1細(xì)胞中HIF-1αmRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，與對照組相比各組間差異具有顯著性(P＜0.01)。其中pRNAT-HIF-1αsi

13、RNAⅢ重組質(zhì)粒的抑制效果最明顯。
　　4、Westernblotting方法檢測顯示，三組分別轉(zhuǎn)染了pRNAT-HIF-αsiRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ重組RNA干擾質(zhì)粒的WERI-Rb-1細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯降低，與對照組相比各組間差異具有顯著性(P＜0.01)。其中pRNAT-HIF-1αsiRNAⅢ重組質(zhì)粒的抑制效果最明顯。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建的特異性針對HIF-1α的RNA干擾重組質(zhì)粒能有效地并特異

14、性地抑制RB細(xì)胞系WERI-Rb-1細(xì)胞株中HIF-1α基因在mRNA與蛋白水平上的表達(dá)。為研究HIF-1α基因在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用提供了有用的工具。
　　第三部分HIF-1α基因沉默對WERI-Rb-1細(xì)胞生長、凋亡以及HIF-1α下游基因表達(dá)的影響
　　目的：
　　探討質(zhì)粒介導(dǎo)的HIF-1α基因沉默在體外水平對人RB細(xì)胞系WERI-Rb-1細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及HIF-1α下游靶基因P53、P

15、21、VEGF及bcl-2家族蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1、MTT比色法檢測HIF-1α基因沉默對WERI-Rb-1細(xì)胞體外增殖的影響
　　2、流式細(xì)胞術(shù)（AnnexinV-PE與7-AAD雙染色法）檢測HIF-1α基因沉默對WERI-Rb-1細(xì)胞凋亡的影響。
　　3、流式細(xì)胞術(shù)檢測HIF-1α基因沉默對WERI-Rb-1細(xì)胞周期的影響。
　　4、Westernblotting檢測HIF-1α基因沉

16、默對WERI-Rb-1細(xì)胞中HIF-1α靶基因P53、P21、VEGF及bcl-2家族蛋白表達(dá)的影響
　　結(jié)果：
　　1、MTT檢測結(jié)果顯示，與同期對照組相比，HIF-1αsiRNA干擾組WERI-Rb-1細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)第1天未發(fā)現(xiàn)增殖抑制，第2天細(xì)胞增殖抑制率為8.24％(P＞0.05)，第3天增殖抑制率為29.6％(P＜0.01)，第4天增殖抑制率為49.1％(P＜0.01)，第五天增殖抑制率為53.2％(P＜0.

17、01)。
　　2、FCM檢測顯示，HIF-1αsiRNA干擾組與同期對照組相比，G1/G0期細(xì)胞數(shù)量增加，S期與G2/M期細(xì)胞數(shù)量減少，在細(xì)胞周期各階段中兩組的細(xì)胞數(shù)量差異均有顯著性(P＜0.01)。
　　3、FCM檢測結(jié)果顯示，缺氧條件下培養(yǎng)48小時后，HIF-1asiRNA干擾組WERI-Rb-1細(xì)胞凋亡水平為48.97％，分別與同期空白對照組(17.53％)、轉(zhuǎn)染試劑組(17.00％)以及陰性質(zhì)粒干擾組(21.59％、

18、)相比，各組間差異均有顯著性(P＜0.01)。
　　4、Westernblotting結(jié)果檢測顯示，與同期對照組相比，HIF-1αsiRNA干擾組WERI-Rb-1細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)各組間差異均無顯著性(P＞0.05);bcl-2與p-p53蛋白表達(dá)輕度減少(P＜0.05);P21與Bax蛋白表達(dá)顯著性增加(P＜0.01);VEGF蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、HIF-1α基因沉默能抑制RB

19、細(xì)胞系WERI-Rb-1細(xì)胞的體外增殖能力，使細(xì)胞周期停滯于G1/G0期，增加腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　2、HIF-1α基因沉默能以非P53依賴形式，通過下調(diào)bcl-2和上調(diào)Bax基因表達(dá)方式增加WERI-Rb-1細(xì)胞的凋亡;同時還可能通過下調(diào)VEGF基因表達(dá)方式減少其腫瘤血管化的形成并控制腫瘤生長。
　　第四部分HIF-1α基因沉默對裸鼠RB移植瘤生長、凋亡及血管化形成的影響
　　目的：
　　探討HIF-1α基因沉

20、默在體內(nèi)水平對裸鼠RB移植瘤的生長凋亡以及血管化形成的影響
　　方法：
　　1、通過裸鼠皮下注射WERI-Rb-1細(xì)胞的方式建立裸鼠RB移植瘤動物模型;采用腫瘤瘤體內(nèi)多點注射方式進(jìn)行RNA干擾抑瘤實驗。
　　2、抑瘤實驗期間定期觀察裸鼠RB移植瘤生長情況，用游標(biāo)卡尺測量并計算各組裸鼠瘤體體積，繪制腫瘤生長曲線;實驗結(jié)束后處死裸鼠，剝離腫瘤組織并測量瘤體終重量，計算抑瘤率。
　　3、Westernblotting方

21、法檢測RNA干擾沉默HIF-1α基因?qū)β闶驲B移植瘤中HIF-1α蛋白表達(dá)的抑制效果。
　　4、采用CD34單克隆抗體標(biāo)記新生微血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫組織化學(xué)方法檢測裸鼠RB移植瘤組織中微血管密度(MVD)。
　　5采用TUNEL法檢測裸鼠RB移植瘤腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1、24只BALB/C(nu/nu)裸鼠右側(cè)前肢腋窩皮下注射WERI-Rb-1細(xì)胞4周后，全部裸鼠皮下RB移植瘤均達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)，且無

22、一例死亡，腫瘤發(fā)生率為100％。
　　2、抑瘤實驗后第6天開始，與同期對照組相比，HIF-1αsiRNA干擾組裸鼠RB移植瘤生長速度明顯減慢(P＜0.01)。
　　3、與同期對照組相比，HIF-1αsiRNA干擾組裸鼠RB移植瘤終重量明顯較輕(P＜0.01)。
　　4、Westernblotting檢測顯示，與同期對照組相比，HIF-1αsiRNA干擾組裸鼠RB移植瘤中HIF-1α蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)。