β-TrCP、β-catenin、IκBα在小鼠胚胎著床過(guò)程中子宮內(nèi)膜的表達(dá)規(guī)律及意義.pdf

1、目的： 本研究運(yùn)用RT-PCR、Western blotting、免疫組織化學(xué)以及激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，檢測(cè)假孕、妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜中β-TrCP及其所降解的靶蛋白β-catenin、IκBα基因與蛋白的表達(dá)、分布規(guī)律、動(dòng)態(tài)變化以及對(duì)胚胎著床的影響，有助于從分子水平探討β-TrCP在胚胎著床過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制，從而為了解人類正常生殖過(guò)程機(jī)制和生殖方面疾病的診斷、治療奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.建立早孕及假孕NI

2、H小鼠動(dòng)物模型，隨機(jī)將孕鼠分為7組作為實(shí)驗(yàn)組，每組6只小鼠（其中D5需12只）。假孕小鼠作為對(duì)照組，收集妊娠D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7以及假孕小鼠子宮及內(nèi)膜組織，-80℃凍存?zhèn)溆谩?2.采用臺(tái)盼蘭尾靜脈注射法分離子宮內(nèi)膜胚胎著床點(diǎn)及其旁組織。 3.運(yùn)用RT-PCR法檢測(cè)p-TrCP mRNA、β-catenin mRNA、IκBαmRNA在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。 4.運(yùn)用免

3、疫組織化學(xué)技術(shù)以及Western blotting法檢測(cè)β-TrCP、β-catenin以及IκBα蛋白在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。 5.運(yùn)用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)胚胎著床點(diǎn)及其旁組織β-TrCP以及IκBα蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.經(jīng)尾靜脈注射臺(tái)盼蘭后，取出雙側(cè)子宮，可見(jiàn)條狀子宮呈現(xiàn)藍(lán)染帶。著床點(diǎn)被藍(lán)染，與非著床點(diǎn)區(qū)別明顯。 2.RT-PCR分析表明：各組小鼠子宮內(nèi)膜均有β

4、-TrCP、β-catenin、IκBα mRNA的表達(dá)，并且存在時(shí)空表達(dá)差異。在妊娠D4時(shí)，β-TrCP表達(dá)水平達(dá)到最高峰，而β-catenin、IκBα表達(dá)水平降至最低。著床位點(diǎn)β-TrCP mRNA水平比旁組織顯著增強(qiáng)（p<0.05），而旁組織中IκBα mRNA水平比著床位點(diǎn)顯著增強(qiáng)（p<0.05）。 3.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：β-TrCP、β-catenin、IκBα蛋白在妊娠早期以及假孕小鼠子宮中均有表達(dá)。從妊娠D1

5、開(kāi)始，β-TrCP蛋白水平逐漸升高，至著床窗口期（D4）達(dá)最高水平（p<0.01），并維持到妊娠D5（p<0.05），以后其表達(dá)逐漸降低至正常水平。β-catenin、IκBα蛋白在著床前期一直維持在較高水平，與假孕對(duì)照組比較有顯著差異（p<0.05），但在著床窗口期（D4）明顯降低（p<0.05），之后又逐漸升高。β-TrCP蛋白主要集中在胞漿表達(dá)，妊娠D1至妊娠D3主要分布于腺上皮、腔上皮，妊娠D4以后集中在基質(zhì)表達(dá)。β-caten

6、in、IκBα蛋白在胞漿、胞核中均有表達(dá)，但主要集中在基質(zhì)表達(dá)，腺上皮、腔上皮表達(dá)較弱。 4.激光掃描共聚焦顯微技術(shù)分析顯示：β-TrCP、IκBα蛋白在假孕對(duì)照、胚胎著床位點(diǎn)及其旁組織中均有表達(dá)。著床位點(diǎn)、旁組織中β-TrCP、IκBα蛋白水平與假孕對(duì)照組比較有顯著差異（p<0.01），著床位點(diǎn)β-TrCP的蛋白水平與旁組織相比，顯著性增高（p<0.05）；相反，旁組織中IκBα蛋白水平與著床位點(diǎn)相比，顯著性增高（p<0.05

7、）。β-TrCP蛋白綠色熒光陽(yáng)性信號(hào)主要分布在腺上皮、腔上皮的胞漿中，基質(zhì)中亦有表達(dá)。IκBα蛋白紅色熒光陽(yáng)性信號(hào)在腺上皮、腔上皮、基質(zhì)的胞漿和胞核中均有表達(dá)。 5.Western blotting顯示：各樣本均于92kDa、60kDa、50kDa、40kDa處分別出現(xiàn)β-catenin、β-TrCP、內(nèi)參Tubulin以及IκBα蛋白條帶。 結(jié)論： 1.β-TrCP、β-catenin、IκBα基因及其蛋白在假

8、孕以及妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜中均有表達(dá)，并存在時(shí)空表達(dá)差異。 2.β-TrCP作為SCF（Skp1-Cull-F-box）復(fù)合物成員之一，參與磷酸化β-catenin、IκBα的泛素化降解。β-TrCP的高水平表達(dá)勢(shì)必造成胞漿中β-catenin、IκBα的較低水平；β-TrCP為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子和NFκB通路的正性調(diào)節(jié)因子，β-TrCP在妊娠D4、D5維持較高水平這一事實(shí)與胚胎著床窗口期Wnt/β