α-(2，3)-(2，6)唾液酸對腫瘤細胞Cx43間隙連接功能影響的研究.pdf

1、間隙連接通訊(gap junction intercellular communication，GJIC)是以細胞間的間隙連接(gap junction，GJ)為途徑進行的細胞間直接的信息交流的一種方式，可允許小于1-2kDa的小分子物質(zhì)如金屬離子、第二信使及其它小分子代謝產(chǎn)物通過，使細胞間可以不通過細胞外空間而達到直接通訊的目的。 GJIC與腫瘤密切相關(guān)，多數(shù)腫瘤細胞表現(xiàn)為GJIC能力降低或喪失，這是腫瘤細胞內(nèi)間隙連接異常，

2、導(dǎo)致間隙連接功能障礙所致。間隙連接異常主要表現(xiàn)為連接蛋白(Cx)的異常，其分子機制可能有以下4個方面：(1)Cx基因突變；(2)Cx mRNA表達降低或異常表達；(3)Cx蛋白分布異常(分布在細胞質(zhì)內(nèi)而不是細胞膜上)；(4)其它蛋白對Cx功能的異常調(diào)節(jié)。 由于間隙連接減少，GJIC水平降低，腫瘤細胞內(nèi)生長刺激信號超過閥值或生長抑制信號達不到閥值，因此腫瘤細胞表現(xiàn)為過度增生和惡性表型。 細胞膜表面的糖鏈有三種存在形式，即支

3、鏈中性糖苷、酸性直鏈蛋白聚糖及糖脂，這些糖綴合物通過糖基化影響蛋白質(zhì)功能，在細胞表面形成分支狀的糖鏈宛如“天線”，傳遞著細胞間信息，參與細胞通訊和信號傳遞。細胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)的改變與疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。 腫瘤細胞表面往往表現(xiàn)糖基異?；?，導(dǎo)致糖鏈異常增多，如出現(xiàn)β(1，6)N-乙酰氨基葡萄糖過度表達，N-乙酰乳糖胺重復(fù)序列、唾液酸化和巖藻糖化升高等。這些變化可放大細胞內(nèi)增殖信號，影響細胞間質(zhì)的粘附、遷移和侵襲特性，導(dǎo)致腫瘤惡性

4、增殖與轉(zhuǎn)移。 一方面腫瘤細胞間的間隙連接功能異常，一方面腫瘤細胞表面表達多種異常糖鏈，間隙連接與糖鏈在腫瘤中的異常增殖及轉(zhuǎn)移中都起著重要作用，但兩者的聯(lián)系及糖鏈對腫瘤間隙連接功能形成的影響研究的較少。 腫瘤細胞的一個重要特點之一是細胞膜表面唾液酸糖鏈含量增加。文獻報道Birgit Rose小組采用衣霉素、苦馬豆堿、粟精胺可以促進細胞間隙連接形成，促進細胞間隙功能增強。衣霉素、苦馬豆堿、粟精胺作用可使細胞表面產(chǎn)生含有不同單

5、糖組成的糖鏈，進而影響唾液酸在糖鏈的末端的形成，考慮到唾液酸在腫瘤中異常高表達是一種普遍現(xiàn)象，上述研究結(jié)果提示我們可能是腫瘤中細胞表面的唾液酸殘基影響了腫瘤細胞的間隙連接功能，從而導(dǎo)致細胞間隙連接通訊降低，發(fā)生了腫瘤細胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)移。 基于上述假設(shè)，本論文旨在利用多種手段，如分子生物學手段、激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)、流式細胞術(shù)，借助于化學調(diào)節(jié)劑觀察唾液酸改變對細胞間隙連接功能的影響，在此基礎(chǔ)上觀察唾液酸糖鏈改變前后連接蛋白的

6、表達、磷酸化水平及細胞上分布及動態(tài)變化，分析與連接蛋白相互作用的其它蛋白，探討唾液酸對細胞間隙連接功能影響的機制。該論文的研究將從一個側(cè)面闡明腫瘤異常糖鏈對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，為糖生物學前沿探索性研究提供實驗依據(jù)。 第一部分： α-(2，3)/(2，6)唾液酸對腫瘤細胞Cx43間隙連接功能的影響 第一章構(gòu)建Hela-Cx43、Hela-Cx43-EGFP穩(wěn)定細胞株 采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE，成功構(gòu)建了

7、穩(wěn)定高表達的Hela-Cx43、Hela-Cx43-EGFP細胞株，為后續(xù)的研究提供實驗材料。 第二章α-(2，3)/(2，6)唾液酸對腫瘤細胞Cx43間隙連接功能的影響 1．衣霉素抑制Hela細胞膜表面N-糖鏈的生成，引起間隙連接功能顯著增強。 2．瞬時干擾Hela細胞糖基轉(zhuǎn)移酶GnTV，降低細胞膜表面β1，6分支，促進間隙連接功能。 3．唾液酸酶降低Hela細胞膜表面唾液酸，間隙連接功能顯著增強。

8、 4．唾液酸酶抑制劑增加NIH-3T3細胞表面唾液酸，間隙連接功能顯著降低。 5、NIH-3T3-STX高表達α2，8 sialic acid，間隙連接功能無明顯變化。 上述實驗結(jié)果表明，腫瘤細胞中唾液酸的高表達，參與介導(dǎo)了細胞間隙連接功能的降低，并且這種降低主要與α2，3 sialic acid與α2，6 sialic acid有關(guān)，而與α2，8 sialic acid無關(guān)。上述結(jié)果也說明了腫瘤由于唾液酸的增加促進

9、腫瘤發(fā)生發(fā)展與細胞間隙連接功能降低有關(guān)。 第二部分： α-(2，3)/(2，6)唾液酸對腫瘤細胞CX43間隙連接功能影響的機制研究 1、Westernblotting結(jié)果表明降低細胞膜表面唾液酸并不改變Cx43的表達及其磷酸化水平；但Cx43連接斑形成增多； 2、Westernblotting結(jié)果表明唾液酸酶作用后細胞ZO--1表達沒有改變，IP及免疫熒光共定位結(jié)果表明唾液酸酶作用后促進了Cx43與ZO-

10、1的結(jié)合； 3、Westernblotting結(jié)果表明唾液酸酶作用后細胞N-cadherin表達沒有改變，IP及免疫熒光共定位結(jié)果表明唾液酸酶作用后促進了Cx43與N-Cadherin復(fù)合物的形成； 4、唾液酸酶作用后細胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平明顯增加，細胞間同質(zhì)粘附增加，以及免疫熒光表明唾液酸降低后可促進N-cadherin的膜成簇。β-catenin可通過α-catenin介導(dǎo)和細胞骨架系統(tǒng)(如微管蛋白)相連，IP

11、及免疫熒光共定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)唾液酸酶作用后促進了細胞β-catenin與N-cadherin的結(jié)合，IP實驗結(jié)果表明唾液酸酶作用后Cx43與β-catenin結(jié)合增多； 5、免疫熒光實驗表明唾液酸酶作用后CX43與微管末端共定位增加； 6、FRAP實驗結(jié)果表明降低細胞膜表面唾液酸能加快Cx43連接斑形成； 7、Pull down實驗結(jié)果表明唾液酸酶作用后N-cadherin分子上唾液酸修飾明顯減少。 上述結(jié)果