α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶對OVCAR3細胞吉非替尼敏感性的研究.pdf

1、實驗目的:
　　 探討高表達α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST6Gal1后，OVCAR3細胞對吉非替尼敏感性的變化，以及可能機制，以期為卵巢癌的靶向治療提供實驗依據(jù)。
　　 實驗方法:
　　 1.不同濃度吉非替尼(0、5、10、25、50、75、100μM)作用OVCAR3細胞24小時，設立空白組，應用MTT技術檢測不同濃度吉非替尼對OVCAR3細胞生長的影響，并計算抑制率。
　　 2.50uM吉非替尼作用OVC

2、AR3細胞24小時，與未加藥組對比，進行流式檢測，結(jié)果經(jīng)CellQuest軟件分析。
　　 3.50uM的吉非替尼作用OVCAR3細胞24小時，利用western-blot技術分析pAKT/AKT、pERK/ERK、pFAK/FAK以及K-RAS等增殖蛋白的表達變化。
　　 4.實時定量PCR(RT-PCR)技術和免疫印跡法(western-blot)技術驗證高表達轉(zhuǎn)染細胞OVCAR3-ST6Gal1穩(wěn)轉(zhuǎn)株基因水平以及蛋

3、白水平的表達。
　　 5.高表達ST6 Gal1后，western-blot技術分析pAKT/AKT、pERK/ERK、pFAK/FAK以及K-RAS等增殖蛋白的表達變化。
　　 6.不同濃度吉非替尼(0、5、10、25、50、75、100μM)分別作用OVCAR3細胞和OVCAR3-ST6Gal1穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞24小時，MTT檢測探討高表達ST6Gal-1后OVCAR3細胞對吉非替尼敏感性的變化。
　　 7.50u

4、M吉非替尼作用OVCAR3細胞和OVCAR3-ST6Gal1穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞24小時，流式細胞檢測其凋亡率。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.MTT法檢測不同濃度吉非替尼作用24小時，對OVCAR3細胞生長的影響各個濃度吉非替尼的抑制作用與空白組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，抑制率隨著濃度增加而增加，呈劑量依賴性，利用曲線擬合計算其24小時的IC50值為34.80uM。
　　 2.流式細胞技術檢測吉非替尼作用OV

5、CAR3細胞24小時的凋亡率
　　 50uM吉非替尼作用OVCAR3細胞24小時，加藥組與對照組的凋亡率分別為(49.50±7.02)％，(1.91±0.21)％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.探討吉非替尼影響OVCAR3細胞增殖的的內(nèi)在機制
　　 50uM的吉非替尼作用OVCAR3細胞后24小時后，Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)參與細胞增殖的P-FAK、pAKT和pERK蛋白以及K-RAS

6、表達明顯降低，而相對應的非磷酸化水平卻無明顯改變。
　　 4.OVCAR3-ST6Gal1穩(wěn)轉(zhuǎn)株無論在基因水平和蛋白水平，其ST6Gal1表達均高于野生株細胞
　　 Real-time PCR結(jié)果顯示OVCAR3-ST6Gal1穩(wěn)轉(zhuǎn)株的ST6Gal1基因表達水平高于OVCAR3對照組;Western-blot結(jié)果顯示OVCAR3-ST6Gal1穩(wěn)轉(zhuǎn)株的ST6Gal1蛋白表達水平高于OVCAR3對照組，說明已成功轉(zhuǎn)染ST6

7、Gal1基因(P＜0.05)。
　　 5.ST6Gal1表達增加伴隨增殖蛋白表達降低
　　 Western-blot檢測結(jié)果顯示OVCAR3-ST6Gal1穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞中，參與細胞增殖的磷酸化或非磷酸化FAK、AKT和ERK蛋白以及RAS表達明顯降低(P＜0.05)。
　　 6.高表達ST6Gal-1降低了OVCAR3細胞對吉非替尼敏感性
　　 不同濃度吉非替尼作用于OVCAR3細胞以及OVCAR3-ST6

8、Gal1穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞24小時，發(fā)現(xiàn)兩者細胞增殖抑制率均隨著濃度的增加而增加，其對應的IC50值分別為(34.96±1.70) uM，(66.84±2.89) uM。高表達ST6Gal1使OVCAR3細胞對吉非替尼的敏感性降低約2倍(P＜0.05)。即高表達ST6Gal1增加了卵巢癌OVCAR3細胞對吉非替尼的耐藥性。
　　 7.高表達ST6Gal-1增加了吉非替尼對OVCAR3細胞的凋亡率
　　 50uM吉非替尼作用OVC