α2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶Ⅲ調(diào)節(jié)卵巢癌細胞對紫杉醇敏感性的研究.pdf

1、研究目的：
　　本課題研究α2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶Ⅲ（ST3Gal-Ⅲ）在卵巢癌株對紫杉醇敏感性中的作用，探討二者對腫瘤細胞殺傷的協(xié)同效應(yīng)，為臨床治療復(fù)發(fā)性和耐藥性卵巢癌提供新的思路。
　　研究方法：
　　1.了解ST3Gal-Ⅲ在卵巢癌細胞株SKOV3和HO8910PM中的表達差異：qRT-PCR檢測HO8910PM、SKOV3細胞株ST3Gal-Ⅲ的基因表達水平，流式細胞術(shù)檢測在ST3Gal-Ⅲ作用下結(jié)合于細胞表面的生

2、物素標記懷槐凝集素MALII的平均熒光強度。
　　2.CCK-8法檢測高、低表達ST3Gal-Ⅲ卵巢癌細胞株對紫杉醇的化療敏感性：CCK-8法檢測不同劑量梯度范圍內(nèi)紫杉醇持續(xù)作用24h，對比HO8910PM、SKOV3的增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度（IC50），評估ST3Gal-Ⅲ的表達與卵巢癌細胞株對紫杉醇的化療敏感性的相關(guān)性。
　　3. qRT-PCR檢測ST3Gal-Ⅲ siRNA對高表達ST3Gal-Ⅲ的HO8910-P

3、M細胞株的下調(diào)效率。4.Western Blot檢測先后經(jīng)ST3Gal-Ⅲ siRNA轉(zhuǎn)染、紫杉醇處理后的不同ST3Gal-Ⅲ表達水平的HO8910PM細胞株caspase家族凋亡蛋白的改變，同時聯(lián)合顯色法TUNEL、FACS法檢測各組HO8910PM細胞凋亡效應(yīng)。探討唾液酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑(ST3Gal-Ⅲ siRNA)聯(lián)合紫杉醇對HO8910PM細胞株的毒性差異。
　　5. qRT-PCR檢測紫杉醇對低表達ST3Gal-Ⅲ的SKO

4、V3細胞株的ST3Gal-Ⅲ mRNA表達的影響:通過比較不同劑量梯度、作用時間紫杉醇誘導(dǎo)低表達ST3Gal-Ⅲ的SKOV3細胞表面的ST3Gal-Ⅲ mRNA表達水平的變化差異，探討紫杉醇對SKOV3細胞株ST3Gal-Ⅲ表達的影響作用和特征規(guī)律。
　　6. qRT-PCR檢測先后經(jīng)紫杉醇、ST3Gal-Ⅲ siRNA處理后的不同處理組的SKOV3細胞ST3Gal-Ⅲ表達。
　　7. Western Blot檢測先后經(jīng)紫杉

5、醇、ST3Gal-Ⅲ siRNA處理后，SKOV3細胞株ST3Gal-Ⅲ表達與 caspase家族凋亡蛋白的相關(guān)性，進一步應(yīng)用顯色法 TUNEL、FACS法檢測各組SKOV3細胞凋亡效應(yīng)。研究不同ST3Gal-Ⅲ表達水平的SKOV3細胞株對紫杉醇化療藥物敏感性的差異，探討ST3Gal-Ⅲ對SKOV3細胞化療敏感性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.卵巢癌細胞株SKOV3、HO8910PM的ST3Gal-Ⅲ基因表達水平及細胞表面ST

6、3Gal-Ⅲ表達水平均存在明顯差異：qRT-PCR檢測證實ST3Gal-Ⅲ mRNA在卵巢癌細胞株SKOV3、HO8910PM中表達存在差異表達（P＜0.05）；流式檢測生物素標記懷槐凝集素MALII結(jié)合細胞表面的α2，3-唾液酸的表達水平存在顯著差異（P＜0.05）；HO8910PM細胞株ST3Gal-Ⅲ表達水平明顯高于SKOV3細胞株。
　　2.高、低表達ST3Gal-Ⅲ卵巢癌細胞株的紫杉醇化療敏感性不同：通過CCK8法檢測不

7、同劑量梯度范圍內(nèi)紫杉醇作用SKOV3、HO8910PM細胞株24h的細胞增殖抑制率，高表達的HO8910PM細胞株的增殖抑制率明顯低于低表達的SKOV3細胞株，HO8910PM細胞株（IC50=395.078nmol/L）的紫杉醇半數(shù)抑制濃度約為SKOV3細胞株的（IC50=130.645nmol/L）的3倍。
　　3.唾液酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑能夠有效下調(diào)HO8910PM細胞株ST3Gal-Ⅲ表達: qRT-PCR檢測siRNA組ST3

8、Gal-Ⅲ mRNA的相對表達量為對照組的0.239±0.859倍，兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；經(jīng)紫杉醇處理后的PTX+siRNA組ST3Gal-Ⅲ mRNA的相對表達量為PTX+non-siRNA組的0.184±0.037倍，兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。
　　4. HO8910PM細胞株先后經(jīng)ST3Gal-Ⅲ siRNA轉(zhuǎn)染、紫杉醇聯(lián)合處理后caspase家族凋亡蛋白表達增強，細胞凋亡增加：W

9、estern Blot檢測結(jié)果顯示，PTX+siRNA組、siRNA組ST3Gal-Ⅲ蛋白的表達明顯低于對照組、PTX組、PTX-non-siRNA組；PTX+siRNA組caspase凋亡蛋白表達明顯高于其他對照組組。FACS法、顯色法TUNEL檢測各組HO8910PM細胞凋亡情況結(jié)果與上相同。
　　5.紫杉醇上調(diào)SKOV3細胞株ST3Gal-Ⅲ水平：通過不同濃度紫杉醇（0nmol/L、25nmol/L、50nmol/L、100

10、nmol/L），不同藥物處理時間（24h、48h、72h）作用SKOV3細胞株；qRT-PCR檢測結(jié)果顯示紫杉醇作為細胞周期特異性藥物，對卵巢癌細胞 ST3Gal-Ⅲ誘導(dǎo)表達存在一定的時間-劑量相關(guān)性規(guī)律；其中50nmol/L濃度的紫杉醇持續(xù)作用48h時誘導(dǎo)SKOV3細胞株表達上調(diào)效果最為顯著，ST3Gal-Ⅲ mRNA表達量約為對照組的3倍。
　　6. qRT-PCR檢測先后經(jīng)紫杉醇、ST3Gal-Ⅲ siRNA處理后的不同處理

11、組的SKOV3細胞株ST3Gal-Ⅲ表達水平：結(jié)果顯示 PTX+siRNA組 ST3Gal-Ⅲ mRNA的相對表達量顯著低于其余處理組; PTX96h組、PTX+non-siRNA組、PTX48h組紫杉醇藥物處理組 ST3Gal-ⅢmRNA的相對表達量均顯著高于對照組的基礎(chǔ)表達。
　　7. Western blot檢測結(jié)果顯示各組不同ST3Gal-Ⅲ表達水平SKOV3細胞凋亡蛋白表達情況，PTX+siRNA凋亡蛋白表達明顯高于對照

12、組、PTX96h、PTX+non-siRNA組。這與FACS法、顯色法TUNEL檢測各組SKOV3細胞凋亡結(jié)果基本一致。
　　結(jié)論：
　　1、卵巢癌HO8910PM細胞株表面的ST3Gal-Ⅲ表達水平明顯高于SKOV3細胞株。
　　2、低表達ST3Gal-Ⅲ的SKOV3細胞株對紫杉醇更為敏感，而高表達ST3Gal-Ⅲ的HO8910PM細胞株對紫杉醇更為耐受。
　　3、ST3Gal-Ⅲ siRNA聯(lián)合紫杉醇能夠增強